PPI-Techniken bei denen Mikroplattenleser verwendet werden

Mikroplatten-Reader sind eine breite Gruppe von Instrumenten, die sowohl Einzeltechnologie-Reader als auch Multimode-Reader umfassen. Der Hauptvorteil von Mikroplatten-Readern gegenüber anderen verfügbaren Instrumenten zur Messung von PPI-Techniken besteht darin, dass sie viele Proben in kurzer Zeit messen können: Alle Reader können 96-Well-Mikroplatten messen, und einige können sogar 384- bzw. 1536-Well-Mikroplatten messen. Darüber hinaus verfügen sie über eine hervorragende Sensitivität bei Fluoreszenz- wie auch Lumineszenzmessungen, was auf den Einsatz von Photomultiplierröhren zurückzuführen ist, die selbst kleinste Mengen an Photonen nachweisen können. Im Vergleich zu bildgebenden Instrumenten wie Konfokalmikroskopen und In-vivo Imaging-Systemen bieten Mikroplatten-Reader jedoch praktisch keine räumlichen Informationen, die eine Lokalisierung der Interaktion ermöglichen würden.

Ein einfacher Absorptionsmikroplatten-Reader, der mit geeigneten Filtern ausgestattet ist, reicht in der Regel aus, um die Aktivität der chromogenen Enzyme zu quantifizieren, die in den Hefe-Zweihybrid- und Split-Ubiquitinsystemen verwendet werden. Auch ein Monochromator-basierender Absorptions-Reader ist für diese Anwendung geeignet.

Jedes Mikroplatten-Luminometer, bzw. Röhrchen-Luminometer, kann zur Quantifizierung der Lumineszenz verwendet werden, die bei der Split-Luciferase-Komplementierung emittiert wird. Für BRET-Assays sollten hingegen Multimode-Reader verwendet werden, da diese mit den erforderlichen Filtern ausgestattet werden können, um die Emission des Akzeptors von derjenigen des Donors zu unterscheiden. BRET-Messungen können auch mit Monochromatoren durchgeführt werden. Die Empfindlichkeit ist jedoch deutlich geringer als bei der Verwendung von Filtern und wird daher nicht empfohlen.

Sowohl FRET als auch Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) können mit jedem Fluoreszenzmikroplatten-Reader mit geeigneten Filtern gemessen werden. Da jedoch der Spektralbereich der möglichen FRET-Paare sehr breit ist, ist es ratsam, jeden Fluorophor, der bei Wellenlängen größer als 600 nm emittiert, gegen den Spektralbereich des Instruments zu prüfen, da in einigen Lesegeräten eine Erweiterung des Spektralbereichs bis 850 oder 900 nm optional ist. Wie im Falle von BRET, ist die FRET-Performance bei der Verwendung von Filtern in der Regel besser, als bei Monochromatoren.

Obwohl es üblich ist, dass moderne Mikrotiterplatten-Reader in der Lage sind, TR-FRET zu messen, ist es manchmal eine optionale Funktion, die bei Low-End- oder älteren Instrumenten fehlen kann. In den Spezifikationen wird jedoch selten der Begriff TR-FRET verwendet: Suchen Sie stattdessen nach TRF (Time-Resolved Fluorescence). Tatsächlich ist eine TR-FRET-Messung aus Instrumentensicht nur die Kombination von 2 TRF-Messungen - eine für den Donor und eine für den Akzeptor.  TR-FRET-Messungen haben ebenfalls eine bessere Performance bei der Messung mit Filtern anstelle von Monochromatoren und es muss wiederum nachgewiesen werden, dass der Spektralbereich des Instruments die Messung aller beteiligten Fluorophore ermöglicht, da die Messung bei 665 nm in einigen TR-FRET-Assays häufig ist.

Fluoreszenz-Lebenszeit Messungen erfordern eine sehr spezifische Hardware und sind in keinem Multimodeleser verfügbar. Während in der Vergangenheit mehrere unterschiedliche Instrumente von verschiedenen Herstellern erhältlich waren, darunter Tecan und Berthold Detection Systems (heute Teil von Berthold Technologies), wurden die meisten von ihnen eingestellt, und zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist der einzige Mikroplattenleser mit Lifetime Fluorescence-Funktionen der NovaFluor PR von Fluorescence Innovations.

Mikroplatten-Reader Empfehlungen von Berthold Technologies für PPI-Studien

MethodeApollo 11 LB 913Centro LB 960Tristar 3Tristar 5Mithras² LB 943
Hefe Zwei-Hybrid System     
Split-ubiquitin system     
FRET (SE FRET)     
TR-FRET     
BiFC     
Fluoreszenz-Lebenszeit FRET     
Split-Luciferase Komplementierung     
BRET