Warum Monochromatoren in Mikroplatten-Readern verwendet werden?

Mikroplatten-Reader werden in einer Vielzahl von Methoden in zahlreichen wissenschaftlichen Bereichen eingesetzt. Einige Methoden, wie z.B. die Lumineszenz, erfordern keine Mittel zur Wellenlängenauswahl, da alle Photonen zur Berechnung der Lumineszenz der Probe gebündelt werden. Die meisten Methoden erfordern jedoch die Fähigkeit, die gemessenen Wellenlängen auf ein schmale Bandbreite zu beschränken: Z. B. die Absorption um das Absorptionsmaximum der interessierenden Substanz zu messen, nur ein einziges Fluorophor anzuregen oder die Emission verschiedener Reporterproteine zu trennen.

Traditionell wurden Filter zur Auswahl der gewünschten Wellenlänge verwendet: Sie sind erschwinglich, einfach zu verwenden und bieten dank ihrer hohen Durchlässigkeit und ihrer Sperreigenschaften eine hohe Empfindlichkeit. Es fehlt ihnen jedoch an Flexibilität, da die Verwendung unterschiedlicher Wellenlängen die Verwendung unterschiedlicher Filtersätze erfordert, und sie sind nicht geeignet, das Spektrum einer Substanz zu messen. Ein Monochromator löst beide Probleme auf einmal. Erfahren Sie mehr über das Prinzip und die verschiedenen Typen von Monochromatoren.

Monochromatoren werden in Mikroplatten-Lesegeräten hauptsächlich zur Messung der Absorption und Fluoreszenzintensität verwendet.

Die wichtigsten Monochromator-Spezifikationen für Mikroplatten-Lesegeräte

Spektralbereich (Wellenlängenbereich)

Viele Mikroplatten-Lesegeräte auf dem Markt decken einen Absorptionsbereich von 230 nm bis 1000 nm ab. Mit unseren Systemen können Sie den Monochromator bis zu 200 nm einsetzen. Bei der Messung der Fluoreszenz können viele Mikroplatten-Reader nur bis zu 700 oder 740 nm messen. Unsere Instrumente können den Bereich bis zu 850 nm abdecken.

 

Spektrale Bandbreite

Die spektrale Bandbreite (auch spektraler Bandpass genannt) ist definiert als die Breite an den Punkten, an denen das Licht den halben Maximalwert erreicht hat (volle Breite bei halbem Maximum, abgekürzt FWHM). Die Spaltbreite bestimmt die spektrale Bandbreite: Je breiter die Spaltbreite, desto schmaler die spektrale Bandbreite. Viele Mikroplatten-Lesegeräte auf dem Markt haben eine feste spektrale Bandbreite. Unsere Mikroplatten-Reader, die mit einem Monochromator ausgestattet sind, verfügen jedoch alle über eine variable Bandbreite: von 4 nm (oder 6, je nach Gerät) bis 22 nm. Eine schmalere Bandbreite verbessert die Auflösung und wird bei der Fluoreszenz empfohlen, wenn Anregungs- und Emissionspeaks sehr nahe beieinander liegen. Eine größere Bandbreite verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis.  Ein Monochromator mit variabler spektraler Bandbreite ist sehr nützlich, um knifflige Assays zu optimieren.

Blockierungseffizienz

Die Blockierungseffizienz ist die Fähigkeit eines Wellenlängenauswahlsystems, unerwünschte Wellenlängen (andere als den im Monochromator ausgewählten Bereich) zu blockieren, und ist entscheidend, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Sie wird als der Anteil des unerwünschten Lichts ausgedrückt, der den Monochromator verlässt: eine Blockierungseffizienz von 10-3 bedeutet, dass 1/1000 des Lichts unerwünschter Wellenlängen nicht blockiert wird und den Monochromator verlässt. Die meisten Mikroplatten-Reader verwenden eine Doppelmonochromator-Konfiguration, um eine Blockierungseffizienz von 10-6 zu erreichen, die für die Mehrzahl der Fluoreszenzintensitäts-Assays erforderlich ist.

Streulicht

Streulicht ist die gemessene Lichtmenge, die aus dem Monochromator austritt und eine andere Wellenlänge besitzt als die gewählte. Es handelt sich um Strahlung, die das Ergebnis von Unvollkommenheiten im dispergierenden Element bzw. von anderen optischen Oberflächen, von Beugungseffekten, anderen optischen Aberrationen oder von beschädigten und verschlissenen Komponenten ist.

Bei Absorptionsmessungen verursacht Streulicht Abweichungen vom Lambert-Beer'schen Gesetz. Bei hohen Absorptionswerten wird das lineare Verhältnis zwischen Absorption und Konzentration stark durch den Faktor des Streulichts beeinflusst. Es führt eine systematische Verzerrung zu niedrigeren Absorptionen bei steigenden Konzentrationen ein. Streulicht ist auch der primäre Einflussparameter für die obere Grenze des linearen dynamischen Bereichs für eine Analyse und wird auch bei Fluoreszenzmessungen Probleme verursachen.

Streulicht wird als ein Bruchteil des aus dem Monochromator austretenden Lichts ausgedrückt: ein Index von 10-4 bedeutet, dass 1/10000 des aus dem Monochromator austretenden Lichts Streulicht ist.

Während die meisten Mikroplatten-Lesegeräte auf dem Markt einen Streulicht-Index zwischen 3 x 10-4 und 5 x 10-4 haben, weisen die von Berthold Technologies hergestellten Geräte einen ausgezeichneten Index von 10-6 auf, d.h. einen mindestens 20-mal besseren Index, der höchste Zuverlässigkeit bei allen monochromatorbasierten Messungen bietet.

Spektrale Auflösung

Die Auflösung ist die minimale Bandbreite, die im Monochromator eingestellt werden kann. Sobald die Monochromatorelemente und ihre Positionen festgelegt sind, wird die Auflösung durch die minimale Spaltbreite bestimmt.  Die Auflösung ist entscheidend für die genaue Bestimmung des Spektrums einer Probe. Ursprünglich scharfe spektrale Peaks verbreitern sich, wenn sie mit niedriger Auflösung gemessen werden, und können bei Verwendung einer breiten Spaltbreite sogar verschwinden. Ein schmaler Spalt erreicht eine Spektralform, die dem ursprünglichen Spektrum näher kommt. In Abbildung 1 sehen Sie ein Beispiel für die Auswirkung der Auflösung bei einer spektralen Abtastung: Bei einer Auflösung von 4 nm sehen die 3 Peaks um 500 nm flacher aus als bei 1 nm, aber sie sind immer noch leicht zu unterscheiden. Bei einer Auflösung von 15 nm erscheinen sie jedoch als ein einziger Peak verschmolzen, was zu einem Informationsverlust führt.

Die in unseren Mikroplatten-Readern verwendeten Monochromatoren haben eine spektrale Auflösung von 4 oder 6 nm (je nach Gerät), während viele Mitbewerber nur eine Auflösung bei der Fluoreszenz von 9, 15 oder sogar 20 nm besitzen.

Abbildung 1: Auswirkung der Auflösung bei einer spektralen Abtastun

Wann sollten Sie besser mit Filtern und wann mit einem Monochromator messen?

Das hängt vom jeweiligen Assay ab. Bei einigen Messungen, wie z.B. der Fluoreszenz-Polarisation, müssen Filter verwendet werden, da die Polarisation in einem Monochromator nicht leicht abgestimmt werden kann. In anderen Fällen, wie z.B. bei BRET, wird die erforderliche Empfindlichkeit mit Monochromatoren nur schwer zu erreichen sein.

Im Allgemeinen bieten Messungen, die mit Filtern durchgeführt werden, eine höhere Empfindlichkeit als die gleichen Messungen, die mit einem Monochromator in einem vergleichbaren Gerät durchgeführt werden. In vielen Fällen ist die vom Monochromator gebotene Empfindlichkeit jedoch gut genug, und die größere Flexibilität und Bequemlichkeit sind ein willkommenes Plus.

Monochromator-basierte Mikroplatten-Reader von Berthold Technologies bieten das Beste aus beiden Welten: Sie können frei zwischen Filtern und Monochromator wählen und somit die Option, die die beste Leistung für Ihren Assay bietet.

Unsere Mikroplatten-Lesegeräte mit Monochromator

Wir bieten 3 verschiedene Instrumente mit Monochromator an: der TriStar² S LB 942 hat einen Doppelmonochromator für Absorptions- und Fluoreszenzanregung, und der Tristar 5 und Mithras² LB 943 haben zwei Doppelmonochromatoren, einen für Absorptions- und Fluoreszenzanregung und einen für Emission.