Das BRET-Prinzip

BRET basiert auf der Tatsache, dass die aus einer Luciferase-Reaktion gewonnene Energie genutzt werden kann, um ein fluoreszierendes Protein anzuregen, wenn dieses in unmittelbarer Nähe zum Luciferase-Enzym steht. Die Technologie beinhaltet die Verschmelzung von Donor- (Luciferase) und Akzeptor- (fluoreszierende) Molekülen zu interessanten Proteinen. Die Koexpression von Fusionskonstrukten in lebenden Zellen ermöglicht es, deren Interaktion in Echtzeit quantitativ zu untersuchen. Die Energieübertragung erfolgt durch eine nichtstrahlende Dipol-Dipol-Kopplung vom Donor zum Akzeptor in unmittelbarer Nähe (typischerweise innerhalb von 10 nm), was zu einer Fluoreszenzemission bei einer charakteristischen Wellenlänge führt. Die vom Akzeptor abgegebene Energie in Bezug auf die vom Donor abgegebene Energie wird als BRET-Signal oder BRET-Verhältnis bezeichnet. Sie ist abhängig von den spektralen Eigenschaften, dem Verhältnis, dem Abstand und der relativen Ausrichtung der Donor- und Akzeptormoleküle sowie der Stärke und Stabilität der Interaktion zwischen den interessierenden Proteinen

BRET ist dem FRET sehr ähnlich, aber in FRET ist auch der Donor ein fluoreszierendes Protein, das angeregt werden muss. Da BRET keine externe Lichtquelle benötigt, um den Donor anzuregen, hat es einen sehr geringen Hintergrund und leidet nicht unter Problemen, die häufig mit FRET verbunden sind, wie Autofluoreszenz, Lichtstreuung oder Photobleaching. Weitere Vorteile von BRET sind, dass es sich um eine nicht-radioaktive und homogene Technologie handelt und dass das ratiometrische Signal Störungen durch Testbedingungen minimiert.

BRET-Methoden

In den letzten Jahren wurden verschiedene BRET-Methoden entwickelt. Alle von ihnen haben ihre Limitationen und Vorteile. Verschiedene Donor- und Akzeptorpaare und die entsprechenden Wellenlängen finden Sie in der folgenden Tabelle:

MethodeDonorSubstratDonor Emission [nm]AkzeptorAkzeptor Emission [nm]
BRET 1RLucCoelenterazine480eYFP530
BRET 2RLucDeep Blue C™395GFP510
eBRET 2RLuc8Deep Blue C™395GFP510
BRET 3FireflyLuciferin565DsRed583
QD-BRETRLuc/RLuc8Coelenterazine480QDot605
NanoBRETNanoLuc®Furimazine460HaloTag® Ligand618

 

BRET 1

Die ursprüngliche BRET-Methode mit Coelenterazin als Substrat heißt heute BRET 1. Sie zeichnet sich durch starke Signale und eine lange Lebensdauer aus.

 

BRET 2

Im Vergleich zu BRET 1 weist es eine bessere Trennung von Donor- und Akzeptor-Emissionspeaks auf. Dies macht BRET 2 zu einer besseren Wahl für das Screening von Assays, bei denen hohe Signal-Rausch-Abstände erforderlich sind. Eine klare Einschränkung von BRET 2 ist die geringe Lichtemission und die kurze Lebensdauer.

 

Enhanced BRET 2 (eBRET)

eBRET führt zu einem etwa 5-fach besseren Signal als in der ursprünglichen BRET 2-Version. eBRET verwendet eine neue Renilla-Luciferase-Mutante, Rluc8.

 

BRET 3

Die Firefly-Luciferase in BRET 3 zeigt eine geringere zelluläre Autofluoreszenz bei der Emissionswellenlänge (565 nm), hat aber Nachteile durch schwache Signale und Überschneidungen zwischen Donor- und Akzeptor-Emissionspeaks.

 

QD-BRET

Eine ganz neue BRET-Version ist das Quantum Dot-BRET (QD-BRET). Die Emissionsspitzen sind klar getrennt, was QD-BRET ideal für Screening-Anwendungen macht. Nachteile sind die große Größe der QD-Moleküle (1,5 - 6 nm) und die Tatsache, dass eine genetische Kodierung von QD-Proteinen nicht möglich ist. QD-Proteine können in lebenden Zellen nicht exprimiert werden, sondern müssen hinzugefügt werden.

 

NanoBRET™

NanoBRET™ verwendet eine Luciferase, die viel heller ist als herkömmliche Luciferasen, NanoLuc®, und hat eine sehr gute Trennung zwischen Donor-Emission (460 nm) und Akzeptor-Emission (618 nm).

BRET-Anwendungen

BRET kann in Mikroplattenlesern gemessen werden, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen, insbesondere im Bereich der G-Protein gekoppelten Rezeptorforschung. Die Fähigkeit, Interaktionen in lebenden Säugetierzellen zu untersuchen, umgeht viele der Probleme, die mit Techniken wie Co-Immunpräzipitation und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening verbunden sind. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Sensitivität von BRET die Untersuchung von Proteinen in physiologischen Konzentrationen, ein wesentlicher Vorteil gegenüber Techniken, die eine hohe Proteinexpression erfordern.

Insbesondere im Bereich der G-Protein gekoppelten Rezeptorforschung bietet die BRET-Technologie die Möglichkeit, einen homogenen, universellen und funktionellen Assay zu etablieren, der die Tatsache nutzt, dass ß-Arorestin (das natürlich eine Rolle bei der Desensibilisierung der Rezeptoren spielt) an den intrazellulären Teil des aktivierten Rezeptors bindet. G-Protein gekoppelte Rezeptoren, auch 7-Transmembran-(7TM)-Rezeptoren genannt, umfassen die größte und vielfältigste Überfamilie der bekannten Proteine. Zu einem kleinen Teil sind nur die Liganden bekannt.

Um einen Eindruck davon zu bekommen, wie wichtig GPCRs in der Medikamentenentwicklung sind:

  • Derzeit sind ~ 30 % der Medikamente gegen GPCRs gerichtet
  • Nur 5% der bekannten Rezeptoren werden mit Medikamenten behandelt
  • Für nur 20 % des übrigen Restes sind die entsprechenden Liganden bekannt

NanoBRET™ with the Mithras² [Translate to Deutsch:] Beschreibung

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NanoBRET™ with the TriStar² S Promega NanoBRET™ protein:protein interaction system with the TriStar² S Multimode Microplate Reader

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Comparison of filter sets for BRET1 using Mithras Comparison of filter sets for BRET1 assays: ß-arrestin2 (ßARR2) recruitment to the vasopressin V2 receptor using the Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader

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Für BRET empfohlene Mikroplatten-Reader

Ein Mikroplatten-Reader oder Luminometer, der in der Lage ist, Lumineszenz mit hoher Empfindlichkeit unter Verwendung von Filtern zu messen, ist die beste Kombination für BRET. Es können auch Reader mit Monochromatoren verwendet werden, jedoch mit reduzierter Empfindlichkeit. Da zwei Messungen bei unterschiedlichen Wellenlängen durchgeführt werden müssen, ist ein Reader mit mindestens zwei Emissionsfiltern erforderlich (dies ist z.B. bei Lesern mit einem einzigen Filterwürfel mit 1 Anregungsfilter + 1 Emissionsfilter nicht möglich). Alle untenstehenden Mikroplatten-Reader sind für BRET empfohlen.