Time-Resolved FRET kombiniert zeitaufgelöste Methodik mit klassischem FRET, um Assays mit hoher Robustheit und Empfindlichkeit zu kreieren:
- FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) basiert darauf, dass ein Donorfarbstoff (z.B. CFP) in einem angeregten Zustand einen Teil seiner Energie auf ein Akzeptormolekül wie YFP übertragen kann. Die Emission des Akzeptors kann nachgewiesen werden, sobald sich beide Farbstoffe in unmittelbarer Nähe befinden, wenn z.B. die Interaktion zweier Proteine stattgefunden hat. Die Leistung herkömmlicher FRET-Assays wird oft durch die Hintergrundfluoreszenz von Probenkomponenten behindert, aber diese Art der Hintergrundfluoreszenz ist extrem transient (mit einer Lebensdauer im Nanosekundenbereich) und kann daher durch zeitaufgelöste Methoden eliminiert werden.
- Time-Resolved Fluorescence (TRF) verwendet Fluorophore mit einer sehr langen Fluoreszenzlebensdauer, um Störungen durch Moleküle mit einer kurzen Fluoreszenzlebensdauer oder andere Faktoren (vor allem Anregungslicht) zu vermeiden. Die Fluorophore der Wahl sind in der Regel Chelate von Lanthaniden (meist Europium, Terbium und Samarium).
Eine sehr leistungsfähige Variante von TR-FRET ist HTRF®.
TR-FRET Anwendungen
Als Alternative zu FRET wird TR-FRET häufig zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt. Es wurden jedoch auch viele andere Assays zur Messung der Bindung zwischen zwei Makromolekülen entwickelt.
Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with Mithras² Validation of the Mithras² Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay
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Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with TriStar² S Validation of the TriStar² S Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay
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cAMP/IP-One HTplex HTRF® assay with Mithras cAMP/IP-One HTplex cell-based experiment performed on Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader using HTRF® technology
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Für TR-FRET empfohlene Mikroplatten-Reader
Ein Mikroplatten-Reader, der in der Lage ist, Fluoreszenz mit hoher Empfindlichkeit unter Verwendung von Filtern zu messen und mit einer Blitzlampe ausgestattet ist, ist die beste Wahl für TRF (Monochromator-basierte Instrumente können ebenfalls verwendet werden, haben jedoch eine geringere Leistung). Für einige Anwendungen kann ein Detektor mit erweitertem Spektralbereich (über 650 nm) erforderlich sein. Einige gängige TR-FRET Assays messen beispielsweise das Europium-Label bei 665 nm. Alle untenstehenden Mikroplatten-Reader werden für TR-FRET empfohlen.
HTRF® ist eine eingetragene Marke von Cisbio Bioassays.