Pourquoi utiliser un monochromateur dans un lecteur de microplaques?

Les lecteurs de microplaques sont utilisés dans un large éventail de méthodes dans de nombreux domaines scientifiques. Certaines méthodes, telles que la luminescence, ne nécessitent aucun moyen de sélection de la longueur d'onde, car tous les photons sont regroupés pour calculer la luminescence de l'échantillon. Cependant, la plupart des méthodes nécessitent la capacité de limiter les longueurs d'onde mesurées à une bande passante étroite : par exemple, mesurer l'absorption autour du maximum d'absorption de la substance d'intérêt, n'exciter qu'un seul fluorophore ou séparer l'émission de différentes protéines rapporteuses.

Traditionnellement, les filtres étaient utilisés pour sélectionner la longueur d'onde souhaitée : ils sont abordables, faciles à utiliser et offrent une grande sensibilité grâce à leurs propriétés de transmission et de blocage élevées. Toutefois, ils manquent de souplesse, car l'utilisation de différentes longueurs d'onde nécessite l'emploi de différents ensembles de filtres, et ils ne conviennent pas pour mesurer le spectre d'une substance. En savoir plus sur le principe et les types de monochromateurs.

Les monochromateurs sont utilisés dans les lecteurs de microplaques principalement pour mesurer l'absorbance et l'intensité de la fluorescence.

Les spécifications les plus pertinentes des monochromateurs pour les lecteurs de microplaques

Gamme spectrale (gamme de longueur d'onde)

De nombreux lecteurs de microplaques sur le marché couvrent une plage d'absorption de 230 nm à 1000 nm. Avec nos systèmes, vous pouvez utiliser le monochromateur jusqu'à 200 nm. En ce qui concerne la mesure de la fluorescence, de nombreux lecteurs de microplaques ne peuvent mesurer que jusqu'à 700 ou 740 nm. Nos instruments peuvent couvrir la gamme jusqu'à 850 nm.

Largeur de bande spectrale

La largeur de bande spectrale (également appelée bande passante spectrale) est définie comme la largeur aux points où la lumière a atteint la moitié de la valeur maximale (largeur totale à la moitié de la valeur maximale, abrégée FWHM). La largeur de la fente détermine la bande passante spectrale : plus la fente est large, plus la bande passante spectrale est étroite. De nombreux lecteurs de microplaques sur le marché ont une largeur de bande spectrale fixe. Cependant, nos lecteurs de microplaques, qui sont équipés d'un monochromateur, ont tous une largeur de bande variable : de 4 nm (ou 6, selon l'appareil) à 22 nm. Une largeur de bande plus étroite améliore la résolution et est recommandée pour la fluorescence lorsque les pics d'excitation et d'émission sont très proches. Une bande passante plus large améliore le rapport signal/bruit. Un monochromateur à largeur de bande spectrale variable est très utile pour optimiser les essais délicats.

Efficacité du blocage

L'efficacité du blocage est la capacité d'un système de sélection de longueur d'onde à bloquer les longueurs d'onde indésirables (autres que la plage sélectionnée dans le monochromateur), et est essentielle pour obtenir un bon rapport signal/bruit. Elle est exprimée comme la fraction de la lumière indésirable qui sort du monochromateur : une efficacité de blocage de 10-3 signifie que 1/1000 de la lumière des longueurs d'onde indésirables n'est pas bloquée et sort du monochromateur. La plupart des lecteurs de microplaques utilisent une configuration à double monochromateur pour obtenir une efficacité de blocage de 10-6, qui est requise pour la plupart des tests d'intensité de fluorescence.

Lumière parasite

La lumière parasite est la quantité mesurée de lumière qui sort du monochromateur à une longueur d'onde différente de la longueur d'onde sélectionnée. C'est un rayonnement qui résulte d'imperfections dans l'élément de dispersion ou d'autres surfaces optiques, d'effets de diffraction, d'autres aberrations optiques ou de composants endommagés et usés.

Dans les mesures d'absorption, la lumière diffusée provoque des écarts par rapport à la loi de Lambert-Beer. Pour des valeurs d'absorption élevées, la relation linéaire entre l'absorption et la concentration est fortement influencée par le facteur de la lumière diffusée. Cela introduit un biais systématique vers des absorptions plus faibles à des concentrations croissantes. La lumière diffusée est également le principal paramètre d'influence pour la limite supérieure de la gamme dynamique linéaire d'une analyse et va également causer des problèmes dans les mesures de fluorescence.

La lumière parasite est exprimée comme une fraction de la lumière sortant du monochromateur : un indice de 10-4 signifie que 1/10000 de la lumière sortant du monochromateur est de la lumière parasite.

Alors que la plupart des lecteurs de microplaques sur le marché ont un indice de lumière parasite compris entre 3 x 10-4 et 5 x 10-4, les instruments fabriqués par Berthold Technologies ont un excellent indice de 10-6, c'est-à-dire au moins 20 fois supérieur, ce qui assure une fiabilité optimale dans toutes les mesures effectuées à l'aide d'un monochromateur.

Résolution spectrale

La résolution est la bande passante minimale qui peut être réglée dans le monochromateur ; une fois que les éléments du monochromateur et leurs positions sont fixés, la résolution est déterminée par la largeur minimale de la fente. La résolution est essentielle pour déterminer avec précision le spectre d'un échantillon. À l'origine, les pics spectraux nets s'élargissent lorsqu'ils sont mesurés à faible résolution, et peuvent même disparaître en utilisant une large largeur de fente ; une fente étroite permet d'obtenir une forme de spectre plus proche du spectre original. La figure 1 montre un exemple de l'impact de la résolution dans un balayage spectral : avec une résolution de 4 nm, les 3 pics autour de 500 nm semblent plus plats qu'à 1 nm, mais ils sont toujours facilement distinguables ; avec une résolution de 15 nm, en revanche, ils semblent fusionnés en un seul pic, ce qui entraîne une perte d'informations.

Les monochromateurs utilisés dans nos lecteurs de microplaques ont une résolution spectrale de 4 ou 6 nm (selon l'appareil), alors que de nombreux concurrents n'ont qu'une résolution de fluorescence de 9, 15 ou même 20 nm.

Figure 1 : Effet de la résolution spectrale sur un balayage de spectre

Quand faut-il mesurer avec des filtres et quand utiliser un monochromateur ?

Cela dépend de l'essai particulier. Pour certaines mesures, par exemple la polarisation de fluorescence, il faut utiliser des filtres car la polarisation dans un monochromateur ne peut pas être facilement ajustée. Dans d'autres cas, comme celui de BRET, la sensibilité requise sera difficile à obtenir avec des monochromateurs.

En général, les mesures effectuées avec des filtres offrent une sensibilité plus élevée que les mêmes mesures effectuées avec un monochromateur dans un instrument comparable. Dans de nombreux cas, cependant, la sensibilité offerte par le monochromateur est suffisante, et la plus grande flexibilité et la commodité sont un avantage bienvenu.

Les lecteurs de microplaques à base de monochromateur de Berthold Technologies offrent le meilleur des deux mondes : vous êtes libre de choisir entre les filtres et le monochromateur, ce qui vous permet de choisir l'option qui offre les meilleures performances pour votre test.

Nos lecteurs de microplaques avec monochromateur

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Tristar 5 Multimode Microplate Reader

Le Tristar 5 est un lecteur de microplaques modulaire à haute performance, équipé de filtres et de monochromateurs indépendants, sélectionnables par l'utilisateur, aussi bien pour l'excitation et que l'émission