PRINCIPIO DE FRET

FRET se basa en el hecho de que un colorante donante (por ejemplo, CFP) en un estado excitado puede transferir una parte de su energía por acoplamiento dipolo-dipolo no radiante a una molécula aceptora como YFP. La tecnología implica la fusión de proteínas fluorescentes donantes y aceptoras a moléculas de interés. La coexpresión de constructos de fusión en células vivas permite estudiar su interacción en tiempo real de manera cuantitativa. La emisión desde el aceptor puede detectarse tan pronto como ambos colorantes están en estrecha proximidad, por ejemplo, cuando ha tenido lugar la interacción entre dos proteínas.

APLICACIONES DE FRET

FRET se usa analíticamente para muchos ensayos en los que la estructura de una macromolécula cambia o la unión de un ligando a una macromolécula es de interés, especialmente en el estudio de interacciones proteína-proteína.

FRET to Study GPCR Oligomerization with Mithras FRET as a Tool to Study G-protein Coupled Receptor Oligomerization in HEK Cells.

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ALTERNATIVAS A FRET

Una limitación de FRET es el requisito de iluminación externa para iniciar la transferencia de fluorescencia, que puede conducir a ruido de fondo por excitación directa del aceptor, o al fotoblanqueo. Para evitar este inconveniente, se han desarrollado varios métodos alternativos:

  • La transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) usa una luciferasa bioluminiscente como donante, dando como resultado un fondo muy bajo.
  • El FRET resuelto en el tiempo (TR-FRET) utiliza un enfoque diferente para evitar la interferencia: utiliza fluoróforos con una vida media de fluorescencia muy larga para evitar la interferencia causada por moléculas con una vida media de fluorescencia corta u otros factores (lo más importante, la luz de excitación). Los fluoróforos de elección son generalmente quelatos de lantánidos (habitualmente Europio, Terbio y Samario). Esto da como resultado ensayos de alta robustez y sensibilidad, y es popular entre los fabricantes de kits para desarrollar ensayos que miden las interacciones moleculares.

LECTORES DE MICROPLACAS RECOMENDADOS PARA FRET

Un lector de microplacas capaz de medir la fluorescencia con alta sensibilidad usando filtros es la mejor combinación para FRET. Se pueden usar lectores con monocromadores, pero con un rendimiento más bajo. Es necesario realizar 2 mediciones a diferentes longitudes de onda, y por lo tanto se requiere un instrumento con al menos 2 filtros de emisión (esto no es posible, por ejemplo, en instrumentos que usan un único cubo de filtro con 1 filtro de excitación + 1 filtro de emisión). Todos los lectores de microplacas a continuación se recomiendan para FRET.