El término fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) se puede usar con dos significados diferentes:
- La fluorescencia de una muestra monitorizada como una función del tiempo después de la excitación por un pulso de luz. Para la desambiguación, este procedimiento a menudo se llama medición de tiempo de vida de fluorescencia.
- El uso de fluoróforos con fluorescencia con una vida media distintiva para evitar la interferencia causada por moléculas con una fluorescencia de vida media muy diferente, u otros factores (el más importante, la luz de excitación).
Cuando se habla de lectores de microplacas, TRF generalmente se refiere al segundo significado.
Los fluoróforos de elección suelen ser quelatos de lantánidos (más comúnmente Europio, Terbio y Samario), debido a las siguientes propiedades:
- Su vida de fluorescencia está en el rango de microsegundos (μs), mientras que en la mayoría de los fluoróforos la vida de su fluorescencia está en el rango de nanosegundos (ns). Eso permite que la medición se realice mucho después de que la luz de la excitación y la fluorescencia de cualquier otro fluoróforo en la muestra se hayan descompuesto completamente, reduciendo en gran medida el fondo y aumentando así la relación señal-ruido.
- La gran diferencia entre sus longitudes de onda de excitación y emisión (desplazamiento de Stokes) y los picos de emisión estrechos contribuyen a aumentar aún más la relación señal-ruido.
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA RESUELTA EN EL TIEMPO
La gran relación señal/ruido de los métodos basados en TRF proporciona una sensibilidad muy alta. Como consecuencia, se han desarrollado muchos ensayos que usan las propiedades de fluorescencia resuelta en el tiempo de los quelatos de lantánidos. El tipo de ensayo más popular que usa TRF son los ensayos TR-FRET. La vida útil de fluorescencia distintiva y las propiedades espectrales de los diferentes quelatos de lantánidos permiten desarrollar ensayos multiplex.
Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with Mithras² Validation of the Mithras² Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay
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Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with TriStar² S Validation of the TriStar² S Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay
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cAMP/IP-One HTplex HTRF® assay with Mithras cAMP/IP-One HTplex cell-based experiment performed on Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader using HTRF® technology
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LECTORES DE MICROPLACAS ADECUADOS PARA TRF
Un lector de microplacas capaz de medir la fluorescencia con alta sensibilidad usando filtros y equipado con una lámpara de pulsos es la mejor combinación para TRF (también se puede usar un instrumento basado en monocromador, pero con un rendimiento más bajo); un detector con rango espectral extendido (por encima de 650 nm) puede ser necesario para algunas aplicaciones. Todos los lectores de microplacas a continuación se recomiendan para TRF.