Le terme de fluorescence résolue dans le temps (TRF) peut être utilisé avec deux significations différentes :
- La fluorescence d'un échantillon contrôlé en fonction du temps après excitation par une impulsion de lumière. Pour la différencier, cette procédure est souvent appelée mesure de la durée de vie de la fluorescence.
- L'utilisation de fluorophores ayant une durée de vie de fluorescence distincte pour éviter les interférences causées par des molécules ayant une durée de vie de fluorescence très différente ou par d'autres facteurs (surtout la lumière d'excitation).
Lorsqu'on parle de lecteurs de microplaques, le terme TRF fait généralement référence à la deuxième signification.
Les fluorophores de choix sont généralement des chélates de lanthanides (le plus souvent Europium, Terbium et Samarium), en raison des propriétés suivantes :
- Leur durée de vie de fluorescence est de l'ordre de la microseconde (μs), tandis que la plupart des fluorophores ont une durée de vie de fluorescence de l'ordre de la nanoseconde (ns). Cela permet d'effectuer la mesure bien après que la lumière de l'excitation et la fluorescence de tout autre fluorophore de l'échantillon aient complètement disparu, ce qui réduit considérablement le bruit de fond et augmente ainsi le rapport signal/bruit.
- La grande différence entre ses longueurs d'onde d'excitation et d'émission (décalage de Stokes) et les pics d'émission étroits contribuent à augmenter encore le rapport signal/bruit.
LES APPLICATIONS DE LA FLUORESCENCE RÉSOLUE DANS LE TEMPS
Le rapport signal/bruit des méthodes basées sur la TRF offre une sensibilité très élevée. En conséquence, de nombreux tests ont été développés un utilisant les propriétés de fluorescence résolue dans le temps des chélates de lanthanide. Le type d'essai le plus courant utilisant la TRF est l'essai TR-FRET. La durée de vie de la fluorescence et les propriétés spectrales particulières des différents chélates de lanthanide permettent le développement de dosages multiplex.
Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with Mithras² Validation of the Mithras² Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay
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Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with TriStar² S Validation of the TriStar² S Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay
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cAMP/IP-One HTplex HTRF® assay with Mithras cAMP/IP-One HTplex cell-based experiment performed on Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader using HTRF® technology
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LECTEURS DE MICROPLAQUES ADAPTÉS AU TRF
Un lecteur de microplaques capable de mesurer la fluorescence avec une sensibilité élevée à l'aide de filtres et équipé d'une lampe flash est le meilleur choix pour la TRF (un instrument basé sur un monochromateur peut également être utilisé, mais avec des performances moindres) ; un détecteur avec une plage spectrale étendue (au-dessus de 650 nm) peut être nécessaire pour certaines applications. Tous les lecteurs de microplaques ci-dessous sont recommandés pour la TRF.