PRINCIPE DU FRET

Le FRET est basé sur le fait qu'un colorant donneur (par exemple le CFP), à l'état excité, peut transférer une partie de son énergie par couplage dipôle-dipôle non radiatif à une molécule acceptrice comme le YFP. Cette technologie implique la fusion de protéines fluorescentes donneuses et acceptrices en molécules d'intérêt. La co-expression des constructions de fusion dans les cellules vivantes permet d'étudier leur interaction en temps réel de manière quantitative. L'émission de l'accepteur peut être détectée dès que les deux colorants sont à proximité immédiate, par exemple lorsque l'interaction de deux protéines a eu lieu.

DEMANDES DE FRET

Le FRET est utilisé analytiquement pour de nombreux essais lorsque qu'une macromolécule change de structure ou lorsque la liaison d'un ligand à une macromolécule est intéressante, en particulier dans l'étude des interactions protéine-protéine.

FRET to Study GPCR Oligomerization with Mithras FRET as a Tool to Study G-protein Coupled Receptor Oligomerization in HEK Cells.

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ALTERNATIVES AU FRET

Cependant, il existe une limitation du FRET car il exige un éclairage externe afin d'initier le transfert de fluorescence, pouvant entraîner un bruit de fond dans les résultats de l'excitation directe de l'accepteur ou un photoblanchiment. Pour éviter cet inconvénient, plusieurs méthodes alternatives ont été développées:

  • Le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) utilise une luciférase bioluminescente comme donneur, ce qui permet d'obtenir un bruit de fond très faible.
  • Le FRET à résolution temporelle (TR-FRET) utilise une approche différente pour éviter les interférences : il utilise des fluorophores ayant une très longue durée de vie de fluorescence pour éviter les interférences causées par des molécules ayant une courte durée de vie de fluorescence ou d'autres facteurs (surtout la lumière d'excitation). Les fluorophores de choix sont généralement des chélates de lanthanides (le plus souvent l'europium, le terbium et le samarium) et permet d'obtenir des tests d'une grande robustesse et d'une grande sensibilité couramment utilisés par les fabricants de kits développant des tests qui mesurent les interactions moléculaires.

LECTEURS DE MICROPLAQUES RECOMMANDÉS POUR LE FRET

Un lecteur de microplaques capable de mesurer la fluorescence avec une grande sensibilité en utilisant des filtres est la meilleure combinaison pour le FRET. Des lecteurs avec monochromateur peuvent être utilisés, mais avec des performances moindres.. Cela nécessite d'effectuer 2 mesures à des longueurs d'onde différentes, et donc le besoin d'un instrument avec au moins 2 filtres d'émission (ce qui n'est pas possible, par exemple, dans les instruments utilisant un seul cube de filtre avec 1 filtre d'excitation + 1 filtre d'émission). Tous les lecteurs de microplaques ci-dessous sont recommandés pour le FRET.