Die Bedeutung der intrazellulären Kalziummessung

Bivalentes Kalzium ist ein intrazellulärer Botenstoff in vielen eukaryontischen Signaltransduktionswegen. Die meisten Kalziumsignalsysteme haben eines gemeinsam: Sie erzeugen kurze Kalziumimpulse und regulieren damit die Zellfunktionen.

Der intrazelluläre Kalziumspiegel wird in der Regel niedrig gehalten, da Kalzium oft unlösliche Komplexe mit phosphorylierten und carboxylierten Verbindungen bildet. Typischerweise liegen die zytosolischen Kalziumkonzentrationen bei 100 nM. Als Reaktion auf Reize wird Kalzium entweder aus dem externen Medium oder aus internen Speichern freigesetzt, um die Kalziumkonzentration zu erhöhen.

Bestimmung des intrazellulären Kalziums mittels Lumineszenz

Die Überwachung der Veränderungen des intrazellulären Kalziumspiegels mit Hilfe von Aequorin in einer Flash-Lumineszenzreaktion ist hocheffizient. Sowohl die Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (auch bekannt als GPCRs oder 7TM-Rezeptoren), die den Abbau von Inosit-Phospholipid induzieren, als auch die Aktivität von spannungsgesteuerten Kalzium-Ionenkanälen - letztere verursachen einen eher langsamen Zufluss - können mit den Reagenzieninjektoren der Mikroplatten-Reader Centro,TriStar² oder Mithras²  problemlos durchgeführt werden.

Messung von intrazellulärem Kalzium mittels Fluoreszenz

Auch die Konzentration an freiem Kalzium in intakten Zellen kann mit polyzyklischen Chelatoren wie Fura-2 oder Indo-1 überwacht werden. Fura-2 und Indo-1 liefern eine ratiometrische Anzeige, wodurch Effekte durch leckende oder gebleichte Farbstoffe bzw. durch unterschiedliche Testbedingungen reduziert werden.

Die Fluoreszenzeigenschaften beider Farbstoffe verändern sich bei Calciumbindung deutlich und ermöglichen so den direkten Nachweis von Calciumflüssen als Reaktion auf spezifische Signaltransduktionswege. Das Emissionsmaximum von Indo-1 verschiebt sich von ~475 nm im kalziumfreien Medium auf ~400 nm, wenn der Farbstoff mit Kalzium gesättigt ist. Bei Fura-2 verschiebt sich das Absorptionsmaximum von Fura-2 beim Binden von Kalzium von 380 nm auf 340 nm, während die Emission bei 510 nm konstant bleibt. Dies führt zu einer gegenläufigen Änderung der Fluoreszenzintensität: einem Anstieg bei 340 nm und einem Rückgang bei 380 nm.

Der Filterwechsel bei unseren Multimode-Mikroplatten-Readern ist extrem schnell (~150 ms) und ermöglicht so eine hohe Auflösung der Detektion, wenn schnelle Änderungen der Kalziumkonzentration überwacht werden sollen. Die schnelle Reaktionskinetik kann mit mindestens einem Injektor in Leseposition überwacht werden.

Der Fluoreszenzstoff Fluo-4 kann auch zur Überwachung intrazellulärer Kalziumveränderungen eingesetzt werden und hat den Vorteil, dass er mit einer einzigen Messung durchgeführt wird, so dass kein Filterwechsel erforderlich ist. Dies ist von Vorteil, wenn die Veränderungen des intrazellulären Kalziumspiegels für das verwendete Instrument zu schnell sind (z.B. wenn es einen Monochromator verwendet oder einen langsamen Filterwechsel aufweist). Es ist jedoch nicht ratiometrisch, und daher anfälliger für unterschiedliche Testbedingungen, Leckage und Bleaching.

Application Notes zum Thema intrazelluläres Kalzium

Calcium monitoring with the Mithras Calcium monitoring using Fura-2 with the Mithras LB 940 multimode plate reader

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Intracellular Ca2+ with Clonetics™ Primary Sensors and the Orion II Monitoring Intracellular Ca2+ Fluxes with Clonetics™ Primary Sensors using the Orion II Microplate Luminometer

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Screening of GPCR antagonists using Ca2+ measurements and the TriStar² S 3 commercially available compounds are screened for P2Y2 receptor inhibition using the calcium mobilisation assay with two different fluorescent dyes measured on a TriStar² LB 942 multimode microplate reader.

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Zur intrazellulären Kalziummessung empfohlene Instrumente

Wie bereits erwähnt, werden Injektoren in Messposition für intrazelluläre Messungen mit Lumineszenz und schnell schaltende Filter für Messungen mit Fluoreszenz empfohlen. Alle untenstehenden Mikroplatten-Reader  erfüllen diese Empfehlungen.

Mit Injektoren ausgestattete Röhrchenluminometer können auch für intrazelluläre Kalziummessungen mit Lumineszenz eingesetzt werden und eignen sich auch bei geringem Probendurchsatz. Bei Röhren-Leuchtdioden befinden sich die Injektoren immer in der Messposition.