Top-Reading ist in der Regel empfindlicher
Top Reading bietet in der Regel bessere Signal-Rausch-Verhältnisse für lösungsbasierte Assays, wie DNA- oder Proteinquantifizierung. Im Allgemeinen ist das Messen der Fluoreszenz von oben empfindlicher als das Messen von unten. Dies ist eine Folge der Abschwächung und Streuung des Lichts durch die Kunststoffe des Wellbodens, die den Hintergrund erhöhen und die Effizienz der Messung verringern können. Daher sind die Qualität und Dicke des transparenten Kunststoffbodens und die Art des Fluorophors wichtige Faktoren bei der Entwicklung Ihres Assays.
Der Mikroplattentyp ist entscheidend für die Messung von unten
Ein weiterer Faktor, den Sie berücksichtigen sollten, ist natürlich der Plattentyp mit transparentem Boden, den Sie verwenden - verwenden Sie eine opak-wandige Gewebekulturplatte? Ist die Platte weiß oder schwarz? Und ist der transparente Boden entweder aus Polystyrol oder Glas?
Die Beantwortung der obigen Fragen ist eng mit der gewünschten Lichtwellenlänge verbunden. Wenn Sie versuchen, sichtbares Licht (350-900 nm) zu detektieren, reicht normalerweise ein Kunststoffboden aus. Für die Detektion unter 350 nm ist jedoch ein Boden aus UV-transparentem Material erforderlich, zum Beispiel aus Quarz oder modernen COP/COC-Polymeren. Als letztes Mittel können die teureren optischen Glasbodenplatten verwendet werden, die eine Detektion sowohl von oben als auch von unten sowie eine mikroskopische Betrachtung der Zellen mit geringem Hintergrund ermöglichen.
Der Hauptunterschied zwischen weißen und schwarzen Platten besteht in ihren reflektierenden Eigenschaften. Weiße Platten reflektieren das Licht und maximieren das Lichtausgangssignal. Schwarze Platten hingegen absorbieren Licht und reduzieren Hintergrund und Crosstalk. So werden weiße Platten häufig für Lumineszenztests verwendet, während schwarze Platten für Fluoreszenztests verwendet werden.
Wann liefert die Bottom Reading bessere Ergebnisse?
- Bei der Arbeit mit adhärenten Zellen, die am Boden der Platte wachsen und entweder nur an, oder nahe ihrer unteren Anbindungsstelle ein Fluorophor exprimieren, binden oder absondern.
- Chemotaxis-Assays zur Überwachung der Migration von Zellen durch eine Membran. Diese werden typischerweise durch eine Kombination aus Ablesen von oben und unten analysiert.
- Bestimmte zellbasierte Assays (z.B. GeneBLAzer® oder QBT™ Fettsäureaufnahme) können nicht von oben ausgelesen werden, da die optischen Eigenschaften der im Assay verwendeten Puffer die Anregung oder Emission des Fluorophors beeinträchtigen.
Wenn Sie immer noch Zweifel haben, welche Lesetechnologie Sie verwenden sollen, können Sie zunächst ein Protokoll mit sowohl Top- als auch Bottom-Reading verwenden und die Ergebnisse vergleichen, um Ihre endgültige Wahl zu treffen.
GeneBLAzer® ist eine eingetragene Marke der Invitrogen Corporation.
QBT™ Fatty Acid Uptake ist eine Marke von Molecular Devices.