Was ist Crosstalk?

Im Bereich der Mikroplattenmessungen bezeichnet Crosstalk ob ein in einem Well einer Mikroplatte erzeugtes Signal in diesem speziellen Well bleibt oder nicht, ohne die Signale der benachbarten Wells zu beeinflussen. Dies kann zu künstlich erhöhten Signalen führen und stellt ein großes Problem bei der Analyse von Low-Signal-Proben neben High-Signal-Proben dar. Der typische Workaround ist der Versuch, High-Signal-Proben von den anderen zu trennen, um Crosstalk so weit wie möglich zu vermeiden, aber das verschwendet wertvolle Wells und ist keine Option, wenn Ihr Durchsatz hoch ist. Also, was sollten Sie beachten, um den Crosstalk in Ihrem Assay zu minimieren?

Beeinflussung des Crosstalks durch den Assay

Im Allgemeinen ist die Signalstärke Ihres Assays ein wichtiger Aspekt. Assays wie chemilumineszente Assays können relativ hohe Signale erzeugen, was zu einem signifikanten Crosstalk führen kann. Auch die Wellenlänge des emittierten Lichts ist eine weitere Überlegung. Je kürzer die Wellenlänge der Emission, desto höher ist ihr Energieniveau, was Ihren Test anfälliger für Crosstalk macht.

Fluoreszenzassays sind dagegen weniger anfällig für Crosstalk, da normalerweise nur der gemessene Well mit Anregungslicht angestrahlt wird und die Lebensdauer der Fluoreszenz sehr kurz ist (in der Größenordnung von Nanosekunden für schnelle Fluoreszenztests).

Es gibt noch zwei weitere wichtige Faktoren, die den Crosstalk beeinflussen. Einerseits kann die verwendete Mikrotiterplatte einen signifikanten Einfluss auf den Grad des Crosstalks haben. Andererseits gibt es mehrere Erwägungen zum Instrumentendesign, die sich auf die Höhe des Crosstalks auswirken.

Einfluss der Mikrotiterplatte auf den Crosstalk

Mikrotiterplatten für die Assayentwicklung und das High Throughput Screening werden in der Regel aus einem Polystyrol-Polymer hergestellt. Für weiße Platten wird ein optischer Aufheller, Titandioxid, hinzugefügt. Dadurch wird das Reflexionsvermögen mit einer sehr glatten, hellen Oberfläche im Inneren der Wells erhöht. Im Folgenden werden allgemeine Überlegungen zum Plattendesign zusammengefasst, die sich auf den Grad des Crosstalks auswirken den Sie beobachten können:

Kunststoff und Farbe der Mikrotiterplatte

  • Schwarze Mikrotiterplatten weisen die geringste Menge an Crosstalk auf, gefolgt von hellgrauen Mikrotiterplatten
  • Das Crosstalkpotenzial von weißen Mikrotiterplatten variiert mit dem Gehalt an Titandioxid, ist aber typischerweise mittelgroß
  • Klare Mikrotiterplatten sorgen für den höchsten Crosstalk, da Licht die Wände frei passieren kann und sollten niemals für einen Lumineszenztest verwendet warden

Mikrotiterplattendesign

Die Wellgeometrie, der Abstand von Well zu Well sowie die Wanddicke der angrenzenden Wells und der Boden des Wells haben einen Einfluss auf den Grad des Crosstalks, den man beobachten kann.

Berthold Technologies bietet Mikrotiterplatten an, die sich besonders gut für Lumineszenz-, Fluoreszenz- und Absorptionsmessungen eignen.

Einfluss des Instruments auf den Crosstalk

Mikroplatten-Reader mit hoher Leistung verfügen in der Regel über Technologien, die den Crosstalk auf ein vernachlässigbares Maß reduzieren. Im Allgemeinen wird die Anordnung der verschiedenen Komponenten des optischen Wegs optimiert, um zu vermeiden, dass Signale von benachbarten Wells in dem zu analysierenden Well gemessen werden. Darüber hinaus werden physikalische Maskierungsvorrichtungen eingesetzt, um die zu messende Wells von benachbarten Wells zu isolieren.

Bei Berthold Technologies haben wir patentierte Designs, um Signale aus nicht gemessenen Wells zu eliminieren, die automatisch entsprechend dem gewählten Plattenformat positioniert werden. Diese Funktionalität ist in allen unseren Mikroplatten-Readern enthalten. Unsere Crosstalk-Spezifikation für die meisten unserer Plattenleser beträgt 5 x 10-6. Dies entspricht 1.000.000.000 Zählungen in einem bestimmten Well und nur 5 Zählungen in allen benachbarten Wells. Bei Plattenlesern anderer Hersteller haben wir Zählungen in den benachbarten Wells beobachtet, die zwischen 100 und über 5000 variieren. Somit kann ein intelligentes Instrumentendesign den physische Crosstalk zwischen benachbarten Wells effektiv minimieren, so daß es zwischen den Proben zu praktisch keinem Crosstalk mehr kommt.