¿Qué es el crosstalk?
En el campo de las mediciones de microplacas, el crosstalk es la señal producida en un pocillo de una microplaca que interfiere en las señales de los pocillos adyacentes. Esto puede dar como resultado señales elevadas artificialmente y presenta un problema importante cuando se analizan muestras de señal baja adyacentes a muestras de señal alta. La solución típica es tratar de separar las muestras de alta señal de las otras para evitar el crosstalk tanto como sea posible, pero esto es desperdiciar pocillos y no es una buena opción si su caudal de muestras es elevado. Entonces, ¿qué debe considerar para minimizar el crosstalk en su ensayo?
Influencia del ensayo en el cosstalk
En general, la intensidad de la señal de su ensayo es una consideración importante. Los ensayos como los ensayos quimioluminiscentes pueden generar señales relativamente altas, lo que conduce a un crosstalk significativo. Además, la longitud de onda de la luz emitida es otra consideración a tener en cuenta. Cuanto más corta sea la longitud de onda de la emisión, mayor será su nivel de energía, lo que hará que su ensayo sea más propenso al crosstalk.
Por otro lado, los ensayos de fluorescencia son menos propensos al crosstalk, ya que normalmente solo el pocillo medido está iluminado por luz de excitación y la vida útil de la fluorescencia es muy corta (del orden de nanosegundos para ensayos de fluorescencia rápidos).
Hay otros dos factores importantes que afectan al crosstalk: por un lado, la microplaca utilizada puede tener un impacto significativo en el nivel de crosstalk que observará; por otro lado, hay varias consideraciones de diseño del instrumento de medida que afectarán el nivel de crosstalk.
Influencia de la microplaca en el crosstalk
Las microplacas generalmente se fabrican a partir de un polímero de poliestireno. Para placas blancas se añade un abrillantador óptico, dióxido de titanio. Esto es para aumentar la reflectividad con una superficie brillante muy lisa dentro de los pocillos. A continuación se resumen las consideraciones generales de diseño de la placa que afectarán el nivel de crosstalk que observará:
Plástico y color de microplacas
- Las microplacas negras exhiben la menor cantidad de crosstalk, seguidas de las microplacas de color gris claro.
- El potencial de crosstalk de las microplacas blancas varía con el nivel de dióxido de titanio utilizado, pero generalmente es medio.
- Las microplacas transparentes proporcionan la mayor crosstalk, ya que la luz puede cruzar libremente las paredes y nunca debe usarse para ningún ensayo de luminiscencia.
Diseño de la microplaca
La geometría del pocillo, la distancia de pocillo a pocillo, así como el espesor de la pared de los pocillos adyacentes y el fondo del pocillo también afectan el nivel de crosstalk que se observará.
Berthold Technologies proporciona microplacas totalmente adecuadas para mediciones de luminiscencia, fluorescencia y absorbancia.
Influencia del instrumento en el crosstalk
Los lectores de microplacas de alto rendimiento suelen tener tecnologías que reducen el crosstalk a niveles insignificantes. En general, la alineación de los diversos componentes de la ruta óptica se ha optimizado para evitar que la señal de los pocillos adyacentes se mida en el pocillo que se analiza. Además, se han aplicado dispositivos de enmascaramiento físico para aislar el pocillo que se está midiendo de pocillos adyacentes.
En Berthold Technologies hemos patentado diseños para eliminar señales de pocillos no medidos que se posicionan automáticamente según el formato de placa seleccionado. Esta característica está presente en todos nuestros lectores de microplacas. La especificación de crosstalk para la mayoría de nuestros lectores de placas es 10-6. Esto equivale a 1.000.000 cuentas en un pocillo particular y solo 1 cuenta adicional en los pocillos adyacentes. En los lectores de placas de otros fabricantes pueden observarse variaciones desde 100 a más de 5000 cuentas adicionales en los pocillos adyacentes. Como puede ver, el diseño inteligente del instrumento puede minimizar eficazmente el crosstalk físico a prácticamente cero de muestra a muestra.