MÉTODOS BASADOS EN LA ABSORBANCIA
Espectrofotometría UV usando absorbancia a 260 nm
La absorbancia ha sido el método de elección para la cuantificación rutinaria de DNA y RNA desde hace décadas. Es simple y fácil de usar, ya que no se requiere ningún tratamiento adicional de la muestra (que no sea la extracción de DNA) o la reacción con otras sustancias. Sin embargo, no es muy específico (mide todos los ácidos nucleicos en su conjunto) y es sensible a los contaminantes, por lo que exige DNA muy puro para ser preciso. Obtenga más información sobre la pureza del ADN, cómo medirla y cómo afecta la cuantificación.
La absorbancia de las muestras de DNA a 260 nm se mide con frecuencia usando un espectrofotómetro de microvolumen, pero también es posible usar un espectrofotómetro de cubeta o un lector de microplacas.
En este método, la concentración de una sustancia se calcula de acuerdo con la ley de Beer-Lambert en función de su absorbancia. La siguiente fórmula se puede obtener de la formulación original de la ley:
Donde A = absorbancia a una longitud de onda dada, ε = coeficiente de extinción, b = longitud de paso , c = concentración de la muestra.
Por lo tanto, para una longitud de paso (distancia recorrida por la luz en la muestra) de 1 cm, la concentración es igual a la absorbancia a 260 nm (el pico de absorción de ácidos nucleicos), dividido por el coeficiente de extinción.
Fórmula para calcular la concentración de DNA
El dsDNA tiene un coeficiente de extinción de 0,02 (µg/mL)-1 cm-1, por lo tanto:
Se puede usar la misma fórmula con los coeficientes de extinción respectivos para ssDNA (absorbancia x 37 µg/mL) y ssARN (absorbancia x 40 µg/mL). Sin embargo, es importante señalar que la fórmula solo es válida para moléculas de ácido nucleico grandes con una proporción similar de todos los nucleótidos, tales como DNA genómico, plásmidos, etc. Para oligonucleótidos y otras moléculas de ácido nucleico cortas tales como miRNA, el coeficiente de extinción debe calcularse a partir de la secuencia del oligonucleótido.
El método de la difenilamina (test de Dische)
Otro método para cuantificar el DNA por absorbancia es el método de la difenilamina, que se basa en la reacción de la difenilamina con el azúcar desoxirribosa para formar un complejo azul. Este método lleva mucho tiempo, tiene una baja sensibilidad y, por lo tanto, ya no se usa en la mayoría de los laboratorios. Sin embargo, la medición se realiza en el rango visible y se puede realizar a 595 nm con un lector de ELISA estándar si no hay otros instrumentos disponibles.