Clasificación de los métodos in vivo utilizados para estudiar las interacciones proteína-proteína
Hay muchas maneras de clasificar los métodos in vivo que se utilizan para estudiar las interacciones proteína-proteína. Si el enfoque principal es la detección y cuantificación de la interacción, se pueden clasificar utilizando las propiedades del sistema reportero utilizado en cada métodos.
Todos los métodos presentados aquí se basan en un sistema indicador que consta de dos partes: una parte está vinculada a una de las proteínas de interés (a veces llamada proteína "cebo") y la otra a la otra (a veces llamada proteína "presa"). Cuando ambas proteínas interactúan entre sí, las dos partes del sistema indicador quedan en estrecha proximidad y ell tiene un efecto claramente detectable. Los términos "cebo" y "presa" se usan normalmente si hay una proteína de interés y el objetivo es "cazar" a los compañeros que interactúan. Sin embargo, en muchos casos ambas proteínas ya son conocidas y el objetivo es estudiar la interacción con más detalle (por ejemplo, su regulación).
Los métodos mencionados a continuación se discuten con más detalle en Xing et al. 2016.
Métodos según la funcionalidad del sistema reportero
Una diferencia importante es si las dos partes del sistema reportero son funcionales por sí mismas o no.
Ensayos de Complementación de Fragmentos de Proteínas (PCA, Protein fragment Complementation Assays)
En los Ensayos de Complementación de Fragmentos de Proteína (PCA), el indicador es una única proteína que se ha escindido en dos fragmentos. Los fragmentos por sí mismos no son funcionales, pero la proteína puede reconstituirse a sí misma y restauran su funcionalidad cuando ambos fragmentos se aproximan. Por ejemplo, en la prueba de complementación de luciferasa dividida (split luciferase complementation assay), la molécula de luciferasa se divide en dos fragmentos, ninguno de los cuales puede producir luz; pero si ambos fragmentos están lo suficientemente cerca, la luciferasa se reconstituye y puede producir luz de nuevo. Ejemplos de métodos de PCA son el sistema de ubiquitina dividida (split ubiquitin system) y el ya mencionado ensayo de complementación de luciferasa dividida.
Ensayos de dos híbridos (Two-hybrid assays)
En ensayos de dos híbridos, cada parte del sistema informador es una proteína o dominio de proteína que es completamente funcional, pero solo se produce un efecto específico medible cuando ambas partes están lo suficientemente cerca. Por ejemplo, en ensayos de dos híbridos de levadura, tanto el dominio de unión a DNA que está unido a una de las proteínas de interés como el dominio de transactivación que está unido a la otra proteína son independientemente estables y funcionales, pero el gen reportero solo se expresa si están en estrecha proximidad entre sí. De manera similar, ambas proteínas fluorescentes usadas en un ensayo FRET son fluorescentes, pero la proteína aceptora emite luz solo si hay interacción entre las proteínas de interés.
Métodos según la señal detectada
Otra clasificación importante es el tipo de señal generada por el reportero y utilizada para detectar la interacción. Esto afecta a la instrumentación requerida para la detección, las posibilidades que proporciona para una cuantificación precisa, y la idoneidad para el análisis de alto rendimiento y similares.
Métodos basados en la expresión génica
En este tipo de método, si ambas proteínas de interés interactúan, la combinación del dominio de unión a DNA y el dominio de transactivación impulsa la expresión del reportero. Los indicadores son normalmente de dos tipos posibles: marcadores prototróficos, tales como HIS3 o ADE2, que permiten la supervivencia en medio de crecimiento selectivo, o enzimas cromogénicas tales como la beta-galactosidasa, que pueden usarse para la selección mediante coloración azul/blanca de las colonias. Tanto el ensayo de dos híbridos de levadura como el sistema de ubiquitina dividida (véase más adelante) se basan en la expresión génica.
Este tipo de reportero no es capaz de seguir cambios dinámicos en la interacción, y solo puede cuantificarse mediante absorción y usando una enzima cromogénica. Sin embargo, tales indicadores pueden usarse para evaluar grandes números de interacciones binarias mezclando dos tipos de apareamiento haploide que se han transformado con diferentes conjuntos de proteínas de interés. Por lo tanto, son muy útiles para el cribado de interacciones proteína-proteína a gran escala.
En la versión clásica de este método, el dominio de unión a DNA N-terminal del activador transcripcional GAL4 se une a una proteína de interés, y el dominio de transactivación C-terminal al otro. Cuando ambas proteínas interactúan, su asociación produce un factor de transcripción quimérico, que activa la expresión génica corriente abajo de la secuencia de activación corriente arriba GAL1 (Fields and Song 1989). Se han establecido con éxito sondas divididas adicionales. El ensayo de dos híbridos de levadura es fácil de realizar, pero solo puede usarse para estudiar interacciones entre proteínas con localización nuclear.
Este sistema es similar en concepto al sistema de dos híbridos de levadura y es igual de fácil de realizar. Sin embargo, tiene la ventaja adicional de que puede aplicarse prácticamente a cualquier proteína, no sólo a las proteínas nucleares. Como ya se ha explicado, es un tipo de PCA: la proteína ubiquitina se divide en dos fragmentos no funcionales, cada uno de los cuales se fusiona con un miembro del par de proteínas de interés. Cuando ambos fragmentos interactúan, la ubiquitina se reensambla y se vuelve funcional. Esto promueve la escisión a través de la proteasa específica de la ubiquitina. En la versión clásica, este corte conduce a la liberación de un factor de transcripción que activa la expresión del gen reportero.