¿ABSORBANCIA O FLUORESCENCIA?

Los métodos más comunes para la cuantificación del DNA son la espectrofotometría UV y la medición de fluorescencia de los colorantes de unión al DNA. El primer método requiere un sistema de medición que sea adecuado para la medición de la absorción y el último requiere un dispositivo que pueda usarse para la medición de la fluorescencia. Por lo tanto, la primera decisión antes de elegir un instrumento es el método de cuantificación de DNA que se utilizará. Obtenga más información sobre los métodos de cuantificación de DNA.

Lectores de absorbancia

Las dos opciones más importantes para cuantificar la concentración de ADN mediante mediciones de absorción son los espectrofotómetros de microvolumen y los lectores de microplacas de absorbancia.

Espectrofotómetros de microvolumen

En el pasado, el espectrofotómetro de cubeta era la única opción disponible para cuantificar la concentración de DNA mediante mediciones de absorbancia. Sin embargo, su aplicación fue muy limitada debido al gran volumen de muestra requerido y al pequeño volumen de muestra disponible en biología molecular. Aunque la sensibilidad de un espectrofotómetro de cubeta es mejor que la de un espectrofotómetro de microvolumen, la cantidad de muestra requerida es muy grande: 300-400 µL en cubetas semi-micro y 70 µL en cubetas ultra-micro. Un gran avance en la aplicación del método se logró con la introducción de espectrofotómetros de microvolumen, que permiten la medición de pequeñas gotas de la muestra (típicamente 1 µL). Por lo tanto, los espectrofotómetros de cubeta para la cuantificación de DNA se han abandonado en gran medida, y los espectrómetros de microvolumen son el instrumento de elección para las mediciones de absorción de una sola muestra.

Cuantificar DNA con un espectrofotómetro de microvolumen es simple y directo, pero las muestras deben medirse individualmente con una corta etapa de limpieza entre muestras, lo que consume bastante tiempo cuando se necesita cuantificar un gran número de muestras. Por lo tanto, se recomienda el uso de un lector de microplacas para medir más muestras en menos tiempo.

Lectores de absorbancia para microplacas

Los lectores de microplacas pueden medir muchas muestras en poco tiempo: Los formatos de placa típicos son de 96 y 384 pocillos, pero algunos lectores también pueden leer placas con 1536 pocillos o más. Sin embargo, tienen algunas limitaciones en el cálculo de las concentraciones de ADN en comparación con los espectrofotómetros de microvolumen:

  • Requieren volúmenes de muestra más grandes para la medición. Esto depende del tipo de placa y del fabricante. Cuanto mayor es la densidad de pocillos, menor es el volumen de trabajo mínimo, y hay versiones de volumen reducido de los formatos de microplacas más comunes disponibles. En la mayoría de los casos, sin embargo, la medición en microplacas todavía requiere varias veces el volumen de muestra en comparación con la medición en un espectrofotómetro de microvolumen. En la tabla al final de este artículo encontrará el volumen mínimo de trabajo de los formatos más habituales de microplacas
  • Las microplacas de poliestireno estándar no se pueden utilizar para esta aplicación, ya que bloquean la luz UV. Actualmente los principales fabricantes ofrecen microplacas de plásticos especiales que son transparentes a la luz UV. Aunque son más caras que las microplacas de poliestireno, son más asequibles y convenientes que las microplacas de cuarzo o de fondo de cuarzo.
  • La longitud de la paso, que es un factor en la fórmula para calcular la concentración de DNA (ver métodos de cuantificación de DNA) depende de la geometría del pocillo y el volumen de la muestra. Como la fórmula para calcular la concentración de DNA requiere una longitud de trayectoria de 1 cm, la medición en microplacas require la corrección de la longitud de paso. Esta puede calcularse fácilmente midiendo la absorbancia de las muestras a 900 y 975 nm.

Microplacas de microvolumen para cuantificación de DNA

Una solución para los tres problemas es el uso de microplacas de microvolumen. Este tipo de microplacas utiliza pequeños volúmenes de muestra (generalmente 2 µL), es transparente a los rayos UV y tiene una longitud de paso fija que se puede aplicar fácilmente a los cálculos sin mediciones adicionales. Si bien no tienen tantas posiciones de muestra como las microplacas estándar (normalmente 16 en lugar de 96), ofrecen un buen compromiso entre el volumen de muestra y el rendimiento. Para una cuantificación práctica de DNA en nuestros lectores de microplacas, ofrecemos la Placa µDrop, que incluye archivos de parámetros para facilitar la medición y el cálculo utilizando el software LightCompass.

En lo que respecta a la elección del lector de microplacas, el único requisito es poder medir la absorbancia en el UV hasta 230 nm (ya que esta longitud de onda se usa para evaluar la pureza del DNA). Tanto los lectores basados en filtros como los basados en monocromadores son adecuados para esta aplicación, siempre que los filtros necesarios estén disponibles.