FRET Resuelta en el Tiempo combina metodologías resueltas en el tiempo con FRET clásico para crear ensayos de alta robustez y sensibilidad:
- FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) se basa en el hecho de que un fluoróforo donante (por ejemplo, CFP) en un estado excitado puede transferir una parte de su energía a una molécula aceptora como YFP. La emisión del aceptor puede detectarse tan pronto como ambos colorantes estén en estrecha proximidad, por ejemplo, cuando haya tenido lugar la interacción entre dos proteínas. El rendimiento de los ensayos FRET tradicionales a menudo se ve obstaculizado por la fluorescencia de fondo de los componentes de la muestra, pero este tipo de fluorescencia de fondo es extremadamente transitoria (con una vida media en el rango de nanosegundos) y, por lo tanto, se puede eliminar utilizando metodologías resueltas en el tiempo.
- La fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) utiliza fluoróforos con una fluorescencia de vida media muy larga para evitar la interferencia causada por moléculas con una fluorescencia de vida media corta u otros factores (lo más importante, luz de excitación). Los fluoróforos de elección son generalmente quelatos de lantánidos (habitualmente Europio, Terbio y Samario).
Una variante potente de TR-FRET es HTRF®.
APLICACIONES DE TR-FRET
Como alternativa a FRET, TR-FRET se utiliza a menudo para estudiar las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, se han desarrollado muchos otros ensayos que miden la unión entre dos macromoléculas.
Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with Mithras² Validation of the Mithras² Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay
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Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with TriStar² S Validation of the TriStar² S Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay
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cAMP/IP-One HTplex HTRF® assay with Mithras cAMP/IP-One HTplex cell-based experiment performed on Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader using HTRF® technology
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LECTORES DE MICROPLACAS RECOMENDADOS PARA TR-FRET
Un lector de microplacas capaz de medir la fluorescencia con alta sensibilidad usando filtros y equipado con una lámpara de pulsos es la mejor combinación para TRF (también se puede usar un instrumento basado en monocromador, pero con un rendimiento más bajo). Un detector con rango espectral extendido (por encima de 650 nm) puede ser necesario para algunas aplicaciones. Por ejemplo, algunos ensayos TR-FRET populares miden el marcador Europio a 665 nm. Todos los lectores de microplacas a continuación se recomiendan para TR-FRET.
HTRF® es una marca registrada de Cisbio Bioassays.