Das FRET-Prinzip
FRET basiert auf der Tatsache, dass ein Donorfarbstoff (z.B. CFP) im angeregten Zustand einen Teil seiner Energie durch nicht-strahlende Dipol-Dipol-Kopplung auf ein Akzeptormolekül wie YFP übertragen kann. Die Technologie beinhaltet die Fusion von fluoreszierenden Donor- und Akzeptorproteinen zu interessanten Molekülen. Die Koexpression von Fusionskonstrukten in lebenden Zellen ermöglicht es, deren Interaktion in Echtzeit quantitativ zu untersuchen. Die Emission des Akzeptors kann erkannt werden, sobald sich beide Farbstoffe in unmittelbarer Nähe befinden, z.B. wenn die Interaktion zweier Proteine stattgefunden hat.
FRET Anwendungen
FRET wird analytisch für viele Assays verwendet, bei denen die Struktur eines Makromoleküls sich ändert oder die Bindung eines Liganden an ein Makromolekül von Interesse ist, insbesondere bei der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen.
FRET to Study GPCR Oligomerization with Mithras FRET as a Tool to Study G-protein Coupled Receptor Oligomerization in HEK Cells.
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Alternativen zu FRET
Eine Einschränkung von FRET ist die Anforderung an eine externe Lichtquelle, mit der der Fluoreszenztransfer eingeleitet wird, was zu Hintergrundrauschen in den Ergebnissen durch direkte Anregung des Akzeptors oder durch Fotobleiche führen kann. Um diesen Nachteil zu vermeiden, wurden mehrere alternative Methoden entwickelt:
- Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET) verwendet eine biolumineszente Luciferase als Donor, was zu einem sehr niedrigen Hintergrund führt.
- Time-Resolved FRET (TR-FRET) verwendet einen anderen Ansatz zur Vermeidung von Interferenzen: Es verwendet Fluorophore mit einer sehr langen Fluoreszenzlebensdauer, um Interferenzen durch Moleküle mit einer kurzen Fluoreszenzlebensdauer oder andere Faktoren (vor allem Anregungslicht) zu vermeiden. Die Fluorophore der Wahl sind in der Regel Chelate von Lanthaniden (meist Europium, Terbium und Samarium). Dies führt zu Assays mit hoher Robustheit und Empfindlichkeit und ist bei Kit-Herstellern beliebt, um Assays zu entwickeln, die molekulare Wechselwirkungen messen.
Für FRET empfohlene Mikroplatten-Reader
Ein Mikroplatten-Reader, der in der Lage ist, Fluoreszenz mit hoher Empfindlichkeit unter Verwendung von Filtern zu messen, ist die beste Kombination für FRET. Reader mit Monochromatoren können verwendet werden, aber mit einer schlechteren Leistung. Es ist notwendig, 2 Messungen bei unterschiedlichen Wellenlängen durchzuführen, weshalb ein Gerät mit mindestens 2 Emissionsfiltern erforderlich ist (dies ist z.B. bei Geräten mit einem einzigen Filterwürfel mit 1 Anregungsfilter + 1 Emissionsfilter nicht möglich). Alle untenstehenden Mikroplatten-Reader werden für FRET empfohlen.