Methoden zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen - Berthold Technologies GmbH & Co.KG

Klassifizierung von in vivo Methoden zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen

Es gibt viele Möglichkeiten der Klassifizierung von in vivo-Methoden, die zur Untersuchung von PPI verwendet werden. Steht insbesondere die Erkennung und Quantifizierung der Interaktion im Vordergrund, so kann man sie anhand der Eigenschaften des Reportersystems klassifizieren, das von den jeweiligen Methoden verwendet wird.

Alle hier vorgestellten Methoden basieren auf einem Reporter-System das aus zwei Teilen besteht: Der eine Teil ist mit dem einen der interessierenden Proteine (manchmal als "Köder"-Protein bezeichnet) und der andere mit dem anderen interessierenden Protein (manchmal als "Beute"-Protein bezeichnet) verbunden. Wenn beide Proteine miteinander interagieren, werden die beiden Teile des Reporter-Systems in räumliche Nähe gebracht und haben eine eindeutig nachweisbare Wirkung. Die Begriffe "Köder" und "Beute" werden normalerweise verwendet, wenn es ein Protein von Interesse gibt und das Ziel darin besteht, nach interagierenden Partnern zu "jagen". In vielen Fällen sind jedoch beide Partner bereits bekannt und das Ziel ist es, die Interaktion genauer zu untersuchen (z.B. ihre Regulation).

Die nachfolgend genannten Methoden werden in Xing et al. 2016 näher erläutert.

Methoden nach der Funktionalität des Reporter-Systems

Ein wichtiger Unterschied ist, ob die beiden Teile des Reporter-Systems von selbst voll funktionsfähig sind oder nicht.

Proteinfragment Komplementatierungs-Assays (Protein fragment Complementation Assays, PCA)

Bei dem Proteinfragment-Complementation Assays (PCA) ist der Reporter ein einzelnes Protein, das in zwei Fragmente gespalten wurde. Die Fragmente allein sind nicht funktionsfähig, aber das Protein kann sich wiederherstellen, wenn beide Fragmente in relative Nähe zueinander gebracht werden, und seine Funktionalität wiederherstellen. So wird beispielsweise beim Split-Luciferase-Komplementierungstests das Luciferase-Molekül in zwei Fragmente gespalten, von denen keines Licht produzieren kann, aber wenn beide Fragmente nahe genug sind, rekonstituiert sich die Luciferase und kann wieder Licht erzeugen. Beispiele für PCA-Methoden sind das Split-Ubiquitinsystem und der Split-Luciferase-Komplementationsassay.

Zwei-Hybrid-Assays

Beim Zwei-Hybrid-Assays ist jeder Teil des Reporter-Systems ein Protein oder eine Proteindomäne, die voll funktionsfähig ist, aber ein spezifischer, messbarer Effekt wird nur erzeugt, wenn beide Teile nahe genug sind. So sind beispielsweise bei Hefe-Zwei-Hybrid-Assays sowohl die DNA-Bindungsdomäne, die mit einem der interessierenden Proteine verknüpft ist, als auch die Transaktivierungsdomäne, die mit dem anderen Protein verknüpft ist, unabhängig voneinander stabil und funktional, aber nur wenn sie sich in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, wird das Reportergen exprimiert. Ähnlich sind beide fluoreszierenden Proteine, die in einem FRET-Assay verwendet werden, fluoreszierend, aber das Akzeptor-Protein emittiert Licht nur dann, wenn es eine Wechselwirkung zwischen den Proteinen von Interesse gibt.

Methoden nach dem detektierten Signal

Eine weitere wichtige Klassifizierung ist die Art des Signals, das durch den Reporter erzeugt wird und das zur Erkennung der Interaktion verwendet wird. Dies hat Auswirkungen auf die Instrumentierung, die zur Detektion benötigt wird, sowie auf die Möglichkeiten, die es für eine genaue Quantifizierung bietet, und die Eignung für Hochdurchsatzanalysen und dergleichen.

Methoden zur Untersuchung der Genexpression

Wenn beide interessierenden Proteine interagieren, bewirkt bei dieser Art von Verfahren die Kombination der DNA-Bindungsdomäne und der Transaktivierungsdomäne die Expression des Reporters. Bei den Reportern gibt es in der Regel zwei mögliche Formen: prototrophe Marker wie HIS3 oder ADE2, die das Überleben auf einem erschöpften Wachstumsmedium ermöglichen, oder chromogene Enzyme wie ß-Galaktosidase, die für die Selektion durch Blau-Weiß-Färbung der Kolonien verwendet werden können. Sowohl der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay als auch das Split-Ubiquitin-System (siehe unten) basieren auf der Genexpression.

Diese Art von Reportern ist nicht geeignet, dynamischen Veränderungen in der Interaktion zu folgen, und kann nur durch Absorption und bei Verwendung eines chromogenen Enzyms quantifiziert werden. Solche Reporter können jedoch verwendet werden, um eine große Anzahl von binären Interaktionen zu bewerten, indem zwei haploide Paarungstypen miteinander vermischt werden, die mit verschiedenen Arten von Proteinen von Interesse transformiert wurden. Daher sind sie sehr nützlich für das groß angelegte Screening von Protein-Protein-Interaktionen.

In der klassischen Version dieser Methode ist die N-terminale DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsaktivators GAL4 an das eine interessierende Protein und die C-terminale Transaktivierungsdomäne an das andere gebunden. Wenn beide Proteine interagieren, erzeugt ihre Assoziation einen chimären Transkriptionsfaktor, der die Genexpression stromabwärts der stromaufwärts gelegenen Aktivierungssequenz GAL1 aktiviert (Fields and Song 1989). Weitere Split-Sonden wurden erfolgreich etabliert. Der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay ist einfach durchzuführen, kann aber nur zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen mit nuklearer Lokalisation verwendet werden.

Dieses System ist im Konzept dem Hefe-Zwei-Hybrid-System ähnlich und ebenso einfach durchzuführen. Es hat aber den zusätzlichen Vorteil, dass es auf praktisch jedes Protein anwendbar ist, nicht nur auf nukleare. Wie oben erläutert, ist das Split-Ubiquitin System eine Art PCA: Hierbei wird das Protein Ubiquitin in zwei nicht-funktionale Fragmente gespalten, die jeweils mit jedem Mitglied des interessierenden Proteinpaares fusioniert sind. Wenn beide Fragmente interagieren, baut sich Ubiquitin wieder zusammen und wird funktionsfähig. Dadurch wird die Spaltung über die Ubiquitinspezifische Protease gefördert. In der klassischen Version führt diese Spaltung zur Freisetzung eines Transkriptionsfaktors, der dann die Expression des Reportergens aktiviert.

Methoden basierend auf der Fluoreszenzintensität

Fluoreszierende Proteine werden verwendet, um Interaktionen nachzuweisen. Obwohl alle fluoreszenzbasierten Methoden eine höhere Sensitivität und einen höheren Dynamikumfang aufweisen als Methoden, die auf der Genexpression von chromogenen Enzymen basieren, sind nicht alle geeignet, dynamischen Interaktionsänderungen zu folgen.

Die am weitesten verbreitete Methode der Fluoreszenz ist FRET. Bei diesem Verfahren wird das fluoreszierende Donorprotein an das eine der interessierenden Proteine und der Akzeptor an das andere interessante Protein gekoppelt. Wenn es keine Interaktion gibt, sollte nur die Fluoreszenz des Donors nachgewiesen werden. Findet jedoch eine Interaktion statt (mit beiden fluoreszierenden Proteinen in einem Abstand von 10 nm oder näher), so kann das fluoreszierende Donorprotein den Akzeptor über die Resonanzenergieübertragung (Dipol-Dipol-Kopplung) anregen. Es ist normal, dass auch ohne Interaktion eine gewisse Emission des Akzeptors detektiert wird. Dies geschieht da oft ein kleiner Anteil des Anregungslichts auch in der Lage ist, den Akzeptor anzuregen, wenn es eine spektrale Überlappung bei der Anregung der beiden fluoreszierender Proteine gibt - selbst dann, wenn geeignete Filter verwendet werden. Daher wird das FRET-Verhältnis normalerweise für die Quantifizierung verwendet (Emission des Akzeptors dividiert durch die Emission des Donors), wobei ein deutlicher Anstieg des FRET-Verhältnises eine Interaktion anzeigt. Diese Art von FRET wird manchmal als Sensitized Emission FRET (SE-FRET oder seFRET) bezeichnet. Da SE-FRET aber die einzig gängige Methode ist, die bei der Messung von FRET mit einem Mikroplattenleser gängig ist, wird sie üblicherweise einfach als FRET bezeichnet. Andere Arten von FRET, die mit Fluoreszenzmikroskopen verwendet werden, sind FLIM FRET (siehe unten) und FRET-Akzeptor-Photobleiche (hier wird die Zunahme der Fluoreszenz des Donors nach der Photobleiche des Akzeptors gemessen).

Wie die meisten Methoden, die auf der Fluoreszenzintensität basieren, leidet FRET unter einem hohen Hintergrund- und damit niedrigen Signal/Rausch-Verhältnis, weshalb seine Empfindlichkeit eingeschränkt ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden mehrere alternative Methoden entwickelt: BRET (siehe unten) und TR-FRET. In TR-FRET (zeitaufgelöstes FRET) werden Fluorophore mit einer sehr langen Fluoreszenzlebensdauer (meist Chelate von Lanthaniden, meist Europium, Terbium und Samarium) verwendet, um die Interferenz durch Moleküle mit einer kurzen Fluoreszenzlebensdauer oder andere Faktoren (vor allem Anregungslicht) zu umgehen. anstatt Licht zu messen, wenn das Anregungslicht eingeschaltet ist, werden TR-FRET-Messungen Hunderte von Mikrosekunden später durchgeführt. Die Chelate können dann noch immer Licht emittieren, aber alle anderen Fluorophore in der Probe und natürlich das Anregungslicht sind bereits abgeklungen. Die zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF) ist nicht zu verwechseln mit der Fluoreszenz-Lebenszeit (siehe unten).

BiFC ist ein PCA, das ein gespaltenes fluoreszierendes Protein (GFP oder ein anderes) verwendet. Fragmente des Proteins sind nicht fluoreszierend, aber das fluoreszierende Protein rekonstituiert sich, wenn beide Fragmente in die unmittelbare Nähe gebracht werden. Ähnlich wie FRET ist BiFC eine fluoreszierende Methode zur Messung von PPI, aber es gibt einen wichtigen Unterschied: Die Komplementierung der gespaltenen fluoreszierenden Proteinfragmente ist irreversibel, was die Methode ungeeignet für die Untersuchung der Interaktionsdynamik macht. Eine weitere Komplikation bei dieser Methode ist, dass sich die gespaltenen Fragmente schließlich von selbst wieder zusammensetzen, wodurch die Detektion von Falschpositiven erhöht wird und extreme Sorgfalt bei der Planung des Experiments und der Gestaltung geeigneter Kontrollen erforderlich ist. Die Tatsache, dass BiFC irreversibel ist, kann jedoch zu einem Vorteil werden: Mit Hilfe dieser Technik können schwache Wechselwirkungen erkannt und quantifiziert werden, die mit anderen Methoden nur schwer zu untersuchen sind.

Methoden basierend auf Fluoreszenz-Lebenszeit

Die Fluoreszenz-Lebenszeit beschreibt die durchschnittliche Zeit, die ein fluoreszierendes Protein im angeregten Zustand verbringt, bevor es durch die Emission eines Photons in den Grundzustand zurückkehrt. Methoden, die auf der Fluoreszenz-Lebenszeit basieren, beruhen auf der Messung der Lebensdauer einzelner Fluorophore und nicht ihrer Emissionsspektren. Da die Fluoreszenz-Lebenszeit nicht von der Konzentration abhängt, ist die Absorption durch die Probe, die Anregungsintensität oder die spektrale Überlappung robuster als bei intensitätsbasierten Methoden. Die Fluoreszenz-Lebenszeit wird für die Bildgebung in Form der FLIM-Methode (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) verwendet.

FLIM FRET

Ein interessantes Phänomen ist, dass FRET neben einer Erhöhung der Fluoreszenzemission des Akzeptors auch zu einer Verringerung der Fluoreszenzlebenszeit des Donors infolge von Energieübertragung führt. Durch die Kombination mit FLIM zur Visualisierung von FRET kann PPI in vivo mit hoher Zuverlässigkeit untersucht werden, was eine hochdynamische raumzeitliche Auflösung ermöglicht. Ein erfolgreicher Einsatz von FLIM erfordert jedoch anspruchsvolle Hardware-Add-ons und umfangreiche Schulungen.

Fluoreszenz-Lebensdzeitmessungen können auch mit einem Fluorometer durchgeführt werden. Es gibt zwar eine Reihe von Einzelprobenfluorometern, die dieses Verfahren durchführen können, aber die Verfügbarkeit von Mikroplattenlesern, die Fluoreszenz-Lebenszeitmessungen im Hochdurchsatz durchführen können, ist sehr begrenzt.

Methoden basierend auf Lumineszenz

Lumineszente Reporter-Systeme wie die Split-Luciferase-Ergänzungstests sind ebenfalls beliebt. Hier ist der Reporter eine Luciferase und das emittierte Licht kann mit einem Lumineszenz-Reader leicht quantifiziert werden.

Hierbei handelt es sich um ein PCA, das auf der Komplementierung von zwei gespaltenen Fragmenten eines Luciferase-Proteins und dessen anschließender Detektion durch Substratumwandlung und Lichtproduktion beruht. Das Verfahren ist dem BiFC sehr ähnlich, verwendet aber eine Luciferase anstelle eines fluoreszierenden Proteins. Es gibt jedoch einen wichtigen Unterschied: Die Rekonstitution der Luciferase ist in den meisten Fällen reversibel und somit geeignet, dynamische Wechselwirkungen in Echtzeit zu überwachen. Da die meisten Modellorganismen nicht lumineszierend sind, ist die Split-Luciferase-Komplementierung ein sehr empfindliches Detektionssystem mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Sowohl die Firefly-Luciferase als auch die Renilla-Luciferase wurden erfolgreich zur Untersuchung von PPI in vivo eingesetzt. Die Split-Luciferase-Komplementierung ist eine beliebte Methode, um Protein-Protein-Interaktionen in planta zu untersuchen, indem ein Pflanzen In Vivo Imaging System verwendet wird, um Lumineszenz auf transformierten Blättern zu visualisieren.

BRET (Biolumineszenz Resonanz Energietransfer) wurde entwickelt, um einige der Hintergrund-Probleme von FRET zu umgehen. Anstatt ein fluoreszierendes Protein als Donor zu verwenden, wird hier eine Luziferase verwendet. Da Luziferasen durch eine chemische Reaktion Licht produzieren, ist eine externe Lichtquelle zur Anregung jedoch nicht erforderlich. BRET hat daher einen sehr geringen Hintergrund und leidet nicht unter Problemen, die häufig mit FRET verbunden sind, wie zum Beispiel Autofluoreszenz, Lichtstreuung oder Photobleichung.

Die Klassifizierung von BRET als Lumineszenzmethode ist somit durchaus umstritten: Während das gemessene Signal die Emission eines fluoreszierenden Proteins darstellt (z.B. eYFP bei BRET1 und GFP bei BRET2), kann die Anregungslampe nicht verwendet werden (da der Akzeptor durch die Donor-Luziferase über Dipol-Dipol-Kopplung angeregt wird). Zur Detektion von BRET werden deshalb anstelle von Fluoreszenz-, Lumineszenzreader verwendet, weshalb diese Technik aus praktischen Gründen oft als Lumineszenzmethode eingestuft wird.

Alle hier vorgestellten Methoden sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Vergleich von In Vivo Methoden zur Untersuchung von PPIs

In Vivo PPI Methoden
Methode	Signal	Dynamisch?	Großangelegtes Screening von PPIs?	Anmerkungen
Hefe Zwei-Hybrid Assay	Bakterienüberleben/Farbe (Absorption)	Nein	Ja	Kostengünstig, aber beschränkt auf nukleare Proteine
Split-ubiquitin system	Bakterienüberleben/Farbe (Absorption)	Nein	Ja	Kostengünstig
FRET (SE FRET)	Fluoreszenzintensität	Ja	Nein	Hoher Hintergrund
TR-FRET	Zeitaufgelöste Fluoreszenz Intensität	Ja	Nein	Reduzierter Hintergrund im Vergleich zu FRET
BiFC	Fluoreszenzintensität	Nein	Nein	Kann nützlich sein, um schwache Interaktionen zu erkennen.
FLIM FRET	Fluoreszenz-Lebenszeit	Ja	Nein	Sehr zuverlässig, aber anspruchsvolle Ausrüstung erforderlich.
Split-Luciferase Komplementierung	Lumineszenz	Ja	Nein	Exogenes Substrat erforderlich
BRET	Lumineszenz/Fluoreszenz	Ja	Nein	Reduzierter Hintergrund im Vergleich zu FRET; exogenes Substrat erforderlich

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