Metodi per studiare le interazioni proteina-proteina - Berthold Technologies GmbH & Co.KG

Classificazione dei metodi in vivo utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina

Esistono molti modi per classificare i metodi in vivo utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina. Se il focus è in particolare sulla rilevazione e quantificazione dell'interazione, può essere classificata utilizzando le proprietà del sistema reporter utilizzato dai rispettivi metodi.

Tutti i metodi qui presentati si basano su un sistema reporter costituito da due parti: una parte è collegata a una delle proteine di interesse (a volte chiamata proteina "esca") e l'altra all'altra proteina di interesse (a volte chiamata " preda ”). Quando entrambe le proteine interagiscono tra loro, le due parti del sistema reporter vengono portate in stretta vicinanza e hanno un effetto chiaramente rilevabile. I termini "esca" e "preda" sono normalmente usati se c'è una proteina di interesse e l'obiettivo è quello di "cacciare" per i partner che interagiscono. Tuttavia, in molti casi entrambi i partner sono già noti e l'obiettivo è studiare l'interazione in modo più dettagliato (ad esempio, la sua regolazione).

I metodi menzionati di seguito sono discussi in maggiore dettaglio in Xing et al. 2016.

Metodi in base alla funzionalità del sistema reporter

Una differenza importante è se le due parti del sistema reporter sono completamente funzionali da sole o meno.

Assays di complementazione dei frammenti proteici (PCA)

Nel frammento proteico Complementation Assays (PCA), il reporter è una singola proteina che è stata scissa in due frammenti. I frammenti di per sé non sono funzionali, ma la proteina può ricostituirsi quando entrambi i frammenti vengono portati in stretta vicinanza e ripristinano la sua funzionalità. Ad esempio, nel test di complementazione della luciferasi divisa, la molecola della luciferasi viene divisa in due frammenti, nessuno dei quali può produrre luce, ma se entrambi i frammenti sono abbastanza vicini, la luciferasi viene ricostituita e può produrre nuovamente luce. Esempi di metodi PCA sono il sistema di ubiquitina divisa e l’ assay di complementazione della luciferasi divisa.

Assays a due ibridi

Nei assays a due ibridi, ogni parte del sistema reporter è una proteina o un dominio proteico completamente funzionale, ma viene prodotto un effetto specifico e misurabile quando entrambe le parti sono sufficientemente vicine. Ad esempio, nei test con due ibridi di Yeast, sia il dominio di legame al DNA che è collegato a una delle proteine di interesse che il dominio di transattivazione che è collegato all'altra proteina sono stabili e funzionali in modo indipendente, ma il gene reporter è solo espresso se sono vicini l'uno all'altro. Allo stesso modo, entrambe le proteine fluorescenti utilizzate in un assay FRET sono fluorescenti, ma la proteina accettrice emette luce solo se c'è interazione tra le proteine di interesse.

Metodi in base al segnale rilevato

Un'altra importante classificazione è il tipo di segnale generato dal reporter e utilizzato per rilevare l'interazione. Ciò influisce sulla strumentazione richiesta per il rilevamento, sulle possibilità che fornisce per una quantificazione accurata e sull'idoneità per analisi ad alto throughput e simili.

Metodi basati sull'espressione genica

In questo tipo di metodo, se entrambe le proteine di interesse interagiscono, la combinazione del dominio di legame al DNA e del dominio di transattivazione guida l'espressione del reporter. I reporter sono normalmente di due tipi possibili: marcatori prototrofici, come HIS3 o ADE2, che consentono la sopravvivenza su terreno di crescita impoverito, o enzimi cromogenici come la ß-galattosidasi, che possono essere utilizzati per la selezione tramite colorazione blu / bianca delle colonie. Sia il test per due ibridi di Yeast che il sistema split-ubiquitin (vedi sotto) si basano sull'espressione genica.

Questo tipo di reporter non è in grado di seguire i cambiamenti dinamici nell'interazione e può essere quantificato solo mediante assorbimento e utilizzando un enzima cromogenica. Tuttavia, tali reporter possono essere utilizzati per valutare un gran numero di interazioni binarie mescolando due tipi di accoppiamento aploidi che sono stati trasformati con diversi set di proteine di interesse. Quindi, sono molto utili per lo screening su larga scala delle interazioni proteina-proteina.

Nella versione classica di questo metodo il dominio di legame al DNA N-terminale dell'attivatore trascrizionale GAL4 è legato a una proteina di interesse e il dominio di transattivazione C-terminale all'altra. Quando entrambe le proteine interagiscono, la loro associazione produce un fattore di trascrizione chimerico, che attiva l'espressione genica a valle della sequenza di attivazione a monte GAL1 (Fields and Song 1989). Ulteriori sonde separate sono state stabilite con successo. Il test dell'due-ibrido del lievito è facile da eseguire, ma può essere utilizzato solo per studiare le interazioni tra proteine con localizzazione nucleare.

Questo sistema è simile nel concetto al sistema dell'due-ibrido del lievito ed è altrettanto facile da implementare. Tuttavia, ha l'ulteriore vantaggio che può essere applicato praticamente a qualsiasi proteina, non solo alle proteine nucleari. Come spiegato sopra, il sistema split-ubiquitin è una specie di PCA: la proteina ubiquitina è divisa in due frammenti non funzionali, ognuno dei quali è fuso con un membro della coppia di proteine di interesse. Quando i due frammenti interagiscono, l'ubiquitina si riassembla e diventa funzionale. Questo promuove la scissione tramite la proteasi ubiquitina-specifica. Nella versione classica, questa scissione porta al rilascio di un fattore di trascrizione, che poi attiva l'espressione del gene reporter.

Metodi basati sull'intensità della fluorescenza

Le proteine fluorescenti vengono utilizzate per rilevare le interazioni. Sebbene tutti i metodi basati sulla fluorescenza abbiano una maggiore sensibilità e un intervallo dinamico più elevato rispetto ai metodi basati sull'espressione genica degli enzimi cromogenici, non tutti sono adatti per seguire i cambiamenti di interazione dinamica.

Il metodo di fluorescenza più utilizzato è FRET. In questo metodo, la proteina donatrice fluorescente è accoppiata a una delle proteine di interesse e l'accettore all'altra proteina. Se non c'è interazione, dovrebbe essere rilevata solo la fluorescenza del donatore. Tuttavia, se si verifica un'interazione (con entrambe le proteine fluorescenti a una distanza di 10 nm o più vicina), la proteina donatrice fluorescente può eccitare l'accettore tramite trasferimento di energia di risonanza (accoppiamento dipolo-dipolo). È normale che una certa emissione dell'accettore venga rilevata anche senza interazione. Ciò accade perché spesso una piccola porzione della luce di eccitazione è anche in grado di eccitare l'accettore se c'è una sovrapposizione spettrale nell'eccitazione delle due proteine fluorescenti - anche se vengono utilizzati filtri adeguati. Pertanto, il rapporto FRET (emissione dell'accettore diviso per l'emissione del donatore) viene normalmente utilizzato per la quantificazione, con un aumento significativo del rapporto che indica un'interazione. Questo tipo di FRET è a volte indicato come FRET a emissione sensibilizzata (SE-FRET o seFRET). Tuttavia, poiché SE-FRET è l'unico metodo comune utilizzato per misurare FRET con un lettore di micropiastre, di solito viene indicato semplicemente come FRET. Altri tipi di FRET utilizzati con i microscopi a fluorescenza sono FLIM FRET (vedi sotto) e il photobleaching dell'accettore FRET (dove l'aumento di fluorescenza del donatore viene misurato dopo il fotobleaching dell'accettore).

Come la maggior parte dei metodi basati sull'intensità della fluorescenza, FRET soffre di un alto fondo e quindi di bassi rapporti segnale-disturbo, che ne limitano la sensibilità. Sono stati sviluppati diversi metodi alternativi per superare questa limitazione: BRET (vedi sotto) e TR-FRET. In TR-FRET (FRET risolto nel tempo), i fluorofori con una vita di fluorescenza molto lunga (principalmente chelati di lantanidi, come europio, terbio e samario) vengono utilizzati per bypassare l'interferenza di molecole con una breve durata di fluorescenza o altri fattori (in particolare l'eccitazione leggera). Invece di misurare la luce quando la luce di eccitazione è accesa, le misure TR-FRET vengono eseguite centinaia di microsecondi dopo. I chelati possono ancora emettere luce, ma tutti gli altri fluorofori nel campione e ovviamente la luce di eccitazione sono già svaniti. La fluorescenza in tempo risolto (TRF) non deve essere confusa con la durata della fluorescenza (vedi sotto).

BiFC è un PCA che utilizza una proteina fluorescente scissa (GFP o altro). I frammenti della proteina non sono fluorescenti, ma la proteina fluorescente viene ricostituita quando entrambi i frammenti vengono portati in stretta vicinanza. Simile a FRET, BiFC è un metodo fluorescente per misurare il PPI, ma c'è una differenza importante: la complementazione dei frammenti proteici fluorescenti tagliati è irreversibile, rendendo il metodo inadatto per indagare le dinamiche di interazione. Un'altra complicazione con questo metodo è che i frammenti scissi alla fine si ricompongono da soli, il che aumenta la rilevazione di falsi positivi e richiede estrema cura nella pianificazione dell'esperimento e nella progettazione di controlli appropriati. Tuttavia, il fatto che BiFC sia irreversibile può diventare un vantaggio: può essere utilizzato per identificare e quantificare le interazioni deboli che sono difficili da indagare con altri metodi.

Metodi basati sulla durata della fluorescenza

La durata della fluorescenza descrive il tempo medio che una proteina fluorescente trascorre nello stato eccitato prima di tornare allo stato fondamentale emettendo un fotone. I metodi basati sulla durata della fluorescenza si basano sulla misura della durata dei singoli fluorofori piuttosto che sui loro spettri di emissione. Poiché la durata della fluorescenza non dipende dalla concentrazione, dall'assorbimento del campione, dall'intensità di eccitazione o dall'emorragia spettrale, è più robusta dei metodi basati sull'intensità. La durata della fluorescenza viene utilizzata per l'imaging FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy).

FLIM FRET

Un fenomeno interessante è che il FRET non solo aumenta l'emissione di fluorescenza dell'accettore, ma riduce anche la durata della fluorescenza del donatore a causa del trasferimento di energia. La combinazione con FLIM per visualizzare FRET consente di studiare il PPI in vivo con elevata affidabilità, consentendo una risoluzione spazio-temporale altamente dinamica. Tuttavia, un uso corretto di FLIM richiede componenti aggiuntivi hardware sofisticati e una formazione approfondita.

Le misure del tempo di vita della fluorescenza possono anche essere eseguite con un fluorimetro. Mentre ci sono alcuni fluorometri singoli che possono eseguire questa procedura, la disponibilità di lettori di micropiastre che possono eseguire misure di durata della fluorescenza ad alta produttività è molto limitata.

Metodi basati sulla luminescenza

Anche i sistemi reporter luminescenti come gli assays di complementazione split-luciferasi sono popolari. Qui, il reporter è una luciferasi e la luce emessa può essere facilmente quantificata utilizzando un lettore di luminescenza.

Si tratta di un PCA basato sulla complementazione di due frammenti scissi di una proteina luciferasi e sulla sua successiva rilevazione mediante conversione del substrato e produzione di luce. Il metodo è molto simile al BiFC ma utilizza una luciferasi invece di una proteina fluorescente. Tuttavia, c'è una differenza importante: la ricostituzione della luciferasi è reversibile nella maggior parte dei casi, e quindi adatta per monitorare le interazioni dinamiche in tempo reale. Poiché la maggior parte degli organismi modello non è luminescente, la complementazione della luciferasi divisa è un sistema di rilevamento molto sensibile con un elevato rapporto segnale-disturbo. Sia Firefly luciferase che Renilla luciferase sono state utilizzate con successo per studiare PPI in vivo. L'implementazione della luciferasi divisa è un metodo popolare per studiare le interazioni proteina-proteina nella pianta utilizzando un sistema di imaging vegetale in vivo per visualizzare la luminescenza sulle foglie trasformate.

BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) è stato sviluppato per bypassare alcuni dei problemi di fondo di FRET. Invece di utilizzare una proteina fluorescente come donatore, viene utilizzata una luciferasi. Tuttavia, poiché le luciferasi producono luce attraverso una reazione chimica, non è necessaria una sorgente di luce esterna per l'eccitazione. BRET ha quindi uno fondo molto piccolo e non soffre di problemi spesso associati al FRET, come autofluorescenza, dispersione della luce o sbiancamento fotografico.

La classificazione di BRET come metodo di luminescenza è quindi controversa: mentre il segnale misurato rappresenta l'emissione di una proteina fluorescente (es eYFP per BRET1 e GFP per BRET2), la lampada di eccitazione non può essere utilizzata (poiché l'accettore è eccitato dalla luciferasi del donatore tramite accoppiamento dipolo-dipolo). Per il rilevamento di BRET, vengono quindi utilizzati lettori di luminescenza al posto dei lettori di fluorescenza, motivo per cui questa tecnica è spesso classificata come metodo di luminescenza per motivi pratici.

Tutti i metodi discussi qui sono riassunti nella tabella seguente:

Confronto dei metodi In Vivo per studiare il PPI

In Vivo PPI Methods
Metodo	Segnale	Dinamico?	Screening su larga scala degli PPI?	Commenti
Sistema dell'due-ibrido del lievito	Sopravvivenza batterica / colore (assorbanza)	No	Sì	Economico, ma limitato alle proteine nucleari
Sistema split-ubiquitin	Sopravvivenza batterica / colore (assorbanza)	No	Sì	Economico
FRET (SE FRET)	Intensità della fluorescenza	Sì	No	Fondo alto
TR-FRET	Intensità di fluorescenza in tempo risolto	Sì	No	Fondo ridotto rispetto a FRET
BiFC	Intensità della fluorescenza	No	No	Può essere utile per rilevare interazioni deboli
FLIM FRET	Durata della fluorescenza	Sì	No	Sono molto affidabili, ma sono necessarie apparecchiature sofisticate
Complementazione split-luciferasi	Luminescenza	Sì	No	È necessario un substrato esogeno
BRET	Luminescenza / Fluorescenza	Sì	No	Fondo ridotto rispetto a FRET; substrato esogeno necessario

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