ASSORBANZA O FLUORESCENZA?

I metodi più comuni per la quantificazione del DNA sono la spettrofotometria UV e la misura della fluorescenza dei coloranti leganti il DNA. Il primo metodo richiede un sistema di misura adatto alla misura dell'assorbanza e l'ultimo richiede un dispositivo che può essere utilizzato per la misura della fluorescenza. Pertanto, la prima decisione prima di scegliere uno strumento è il metodo di quantificazione del DNA da utilizzare. Ulteriori informazioni sui metodi di quantificazione del DNA.

LETTORI DI ASSORBANZA

Le due opzioni più importanti per la quantificazione della concentrazione di DNA mediante misure dell'assorbanza sono gli spettrofotometri per microvolumi e i lettori di micropiastre ad assorbanza.

Spettrofotometro a microvolumi

In passato, lo spettrofotometro a cuvetta era l'unica opzione disponibile per quantificare la concentrazione di DNA mediante misure di assorbimento. Tuttavia, la sua applicazione era molto limitata a causa del grande volume di campione richiesto e del piccolo volume di campione disponibile in biologia molecolare. Sebbene la sensibilità di uno spettrofotometro a cuvetta sia migliore di quella di uno spettrofotometro a microvolume, la quantità di campione richiesta è molto ampia: 300-400 µL nelle cuvette semi-micro e 70 µL nelle cuvette ultra-micro. Un vero passo avanti nell'applicazione del metodo è stato ottenuto solo con l'introduzione degli spettrofotometri a microvolume, che consentono la misura di minuscole gocce del campione (tipicamente 1 µL). Pertanto, nel frattempo, gli spettrofotometri a cuvetta per la quantificazione del DNA sono stati in gran parte abbandonati e gli spettrometri a microvolume sono lo strumento di scelta per le misure dell'assorbanza di un singolo campione.

Quantificare il DNA con uno spettrofotometro a microvolumi è semplice e diretto, ma i campioni devono essere misurati individualmente con una breve fase di pulizia tra i campioni, che richiede tempo quando è necessario quantificare un gran numero di campioni. Pertanto, si consiglia di utilizzare un lettore di micropiastre per misurare più campioni in meno tempo.

Lettori di assorbanza per micropiastre

I lettori di micropiastre possono misurare molti campioni in breve tempo: i formati tipici delle piastre sono 96 e 384 pozzetti, ma alcuni lettori possono anche leggere piastre con 1536 pozzetti o più. Tuttavia, hanno alcune limitazioni nel calcolo delle concentrazioni di DNA rispetto agli spettrofotometri a microvolume:

  • Richiedono volumi di campione maggiori per la misura. Dipende dal tipo di piastra e dal produttore. Maggiore è la densità del pozzetto, minore è il volume di lavoro, sono disponibili versioni a basso volume dei formati di micropiastre più comuni. Nella maggior parte dei casi, tuttavia, la misura in micropiastre richiede ancora molte volte il volume del campione rispetto alla misura in uno spettrofotometro a microvolume. Nella tabella alla fine di questo articolo troverete il volume minimo di lavoro dei comuni formati di micropiastre
  • Non è possibile utilizzare micropiastre in polistirene standard perché bloccano la luce UV. Micropiastre speciali trasparenti alla luce UV sono attualmente disponibili presso la maggior parte dei principali produttori. Sebbene siano più costose delle micropiastre in polistirene , sono più convenienti delle micropiastre al quarzo o con fondo in quarzo.
  • La lunghezza del percorso, che è un fattore nella formula per calcolare la concentrazione del DNA (vedere i metodi di quantificazione del DNA) dipende dalla geometria del pozzetto e dal volume del campione. Poiché la formula per calcolare la concentrazione di DNA richiede una lunghezza del percorso di 1 cm, la correzione della lunghezza del percorso deve essere utilizzata nella misura della micropiastra. La correzione della lunghezza del percorso può essere facilmente calcolata misurando l'assorbanza dei campioni a 900 e 975 nm.

Micropiastre a microvolume per la quantificazione del DNA

Una soluzione alternativa per tutti e tre i problemi è l'uso di micropiastre a microvolume per la quantificazione del DNA. Questo tipo di micropiastre utilizza piccoli volumi di campione (solitamente 2 µL), è trasparente ai raggi UV e ha una lunghezza del percorso fissa che può essere facilmente applicata ai calcoli senza ulteriori misure. Sebbene non abbiano tante posizioni di campionamento quante sono le micropiastre standard (normalmente 16 invece di 96), offrono un buon compromesso tra volume del campione e produttività. Per una pratica quantificazione del DNA nei nostri lettori di micropiastre, offriamo la piastra µDrop, inclusi i file dei parametri per una facile misura e calcolo utilizzando il software MikroWin.

Per quanto riguarda la scelta del lettore di micropiastre, l'unico requisito è quello di poter misurare l'assorbanza nell'UV, fino a 230 nm (poiché questa lunghezza d'onda viene utilizzata per valutare la purezza del DNA). Sia i lettori basati su filtro basato che quelli basati monocromatore sono adatti per questa applicazione.