PRINCIPIO BRET
BRET si basa sull'energia derivata da una reazione della luciferasi che può essere utilizzata per eccitare una proteina fluorescente se quest'ultima è vicina all'enzima luciferasi. La tecnologia prevede la fusione di molecole donatrici (luciferasi) e accettori (fluorescenti) a proteine di interesse. La co-espressione dei costrutti di fusione nelle cellule viventi consente di studiare la loro interazione in tempo reale in modo quantitativo. L'energia viene trasferita attraverso l'accoppiamento dipolo-dipolo non radiativo dal donatore all'accettore quando si trova in prossimità (tipicamente entro 10 nm), con conseguente emissione di fluorescenza a una lunghezza d'onda specifica. L'energia emessa dall'accettore rispetto a quella emessa dal donatore è denominata segnale BRET. Dipende dalle proprietà spettrali, dal rapporto, dalla distanza e dall'orientamento relativo delle molecole donatrici e accettori, nonché dalla forza e stabilità dell'interazione tra le proteine di interesse.
BRET è molto simile a FRET ma in FRET il donatore è una proteina fluorescente che deve essere eccitata. Poiché BRET non richiede una fonte di luce esterna per eccitare il donatore, ha uno fondo molto basso e non soffre di problemi spesso associati a FRET come l'autofluorescenza, la diffusione della luce o il fotobleaching. Altri vantaggi di BRET sono che si tratta di una tecnologia non radioattiva e omogenea e che il segnale metrico del rapporto riduce al minimo le interferenze dalle condizioni di assay.
METODI BRET
Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi metodi BRET e tutti hanno i loro limiti e vantaggi. Varie coppie di donatori e accettori e le loro lunghezze d'onda corrispondenti possono essere trovate nella tabella seguente:
Metodo | Donatore | Substrato | Emissione del donatore [nm] | Accettore | Emissione accettore [nm] |
|---|---|---|---|---|---|
| BRET 1 | RLuc | Celenterazina | 480 | eYFP | 530 |
| BRET 2 | RLuc | Celenterazina 400a (Deep Blue C™) | 395 | GFP | 510 |
| eBRET 2 | RLuc8 | Celenterazina 400a (Deep Blue C™) | 395 | GFP | 510 |
| BRET 3 | Firefly | Luciferin | 565 | DsRed | 583 |
| QD-BRET | RLuc/RLuc8 | Celenterazina | 480 | QDot | 605 |
| NanoBRET | NanoLuc® | Furimazina | 460 | HaloTag® Ligand | 618 |
BRET 1
Il metodo BRET originale che utilizza la celenterazina come substrato è oggi chiamato BRET 1 ed è caratterizzato da segnali forti e lunga durata.
BRET 2
Rispetto a BRET 1, BRET2 ha una migliore separazione tra i picchi di emissione del donatore e dell'accettore. Questo rende BRET 2 una scelta migliore per i assays in cui sono richiesti rapporti signal / noise elevati. Una chiara limitazione di BRET 2 è la scarsa emissione di luce e la breve durata.
Enhanced BRET 2 (eBRET)
eBRET può avere un segnale fino a 5 volte migliore rispetto alla versione originale BRET 2. eBRET utilizza un nuovo mutante della luciferasi Renilla chiamato Rluc8.
BRET 3
La luciferasi Firefly in BRET 3 mostra un'autofluorescenza cellulare inferiore alla lunghezza d'onda di emissione (565 nm) ma gli svantaggi sono segnali deboli e sovrapposizione tra i picchi di emissione del donatore e dell'accettore.
QD-BRET
Una nuovissima versione BRET è il Quantum Dot-BRET (QD-BRET). I picchi di emissione sono chiaramente separati, il che rende QD-BRET ideale per le applicazioni di screening. Gli svantaggi sono sia le grandi dimensioni delle molecole QD (1,5 - 6 nm) che l’impossibilità di codifica genetica delle proteine QD. Le proteine QD non possono essere espresse nelle cellule viventi e devono essere aggiunte.
NanoBRET™
NanoBRET ™ utilizza una luciferasi molto più luminosa delle luciferasi convenzionali chiamata NanoLuc®. C'è un'ottima separazione tra l'emissione del donatore (460 nm) e l'emissione dell'accettore (618 nm).
APPLICAZIONI BRET
BRET può essere misurato in lettori di micropiastre per studiare le interazioni proteina-proteina, specialmente nel campo della ricerca sui recettori accoppiati a proteine G. La capacità di studiare le interazioni nelle cellule di mammiferi viventi aggira molti dei problemi associati a tecniche come la co-immunoprecipitazione e lo screening dell'due-ibrido del lievito. L'elevata sensibilità di BRET consente lo studio di proteine a concentrazioni fisiologiche, un vantaggio significativo rispetto alle tecniche che richiedono alti livelli di espressione proteica.
Soprattutto nel campo della ricerca sui recettori accoppiati a proteine G, la tecnologia BRET offre l'opportunità di stabilire un assay omogeneo, universale e funzionale. Approfittando del fatto che la ß-arrestina che svolge naturalmente un ruolo nella desensibilizzazione dei recettori; si lega alla parte intracellulare del recettore attivato. I recettori accoppiati a proteine G sono anche indicati come recettori 7-transmembrana (7TM) e comprendono la più grande e diversificata superfamiglia di proteine conosciuta.
Per avere un'idea di quanto siano importanti i GPCR nella scoperta di farmaci:
- Attualmente circa il 30% dei farmaci è mirato contro i GPCR
- Solo il 5% dei recettori conosciuti è mirato con farmaci
- Solo al 20% del resto sono noti i ligandi corrispondenti
NanoBRET™ with the Mithras² Beschreibung
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LETTORI DI MICROPIASTRE CONSIGLIATI PER BRET
Un lettore di micropiastre o un luminometro in grado di misurare la luminescenza con alta sensibilità utilizzando filtri è la migliore combinazione per BRET; possono essere utilizzati anche lettori con monocromatore, ma con sensibilità ridotta. È necessario eseguire 2 misure a diverse lunghezze d'onda, quindi è necessario un lettore con almeno 2 filtri di emissione (questo non è possibile, ad esempio, nei lettori che utilizzano un singolo filtro a cubo con 1 filtro di eccitazione + 1 filtro di emissione). Tutti i lettori di micropiastre riportati di seguito sono consigliati per BRET.