METODI BASATI SULL'ASSORBANZA
Spettrofotometria UV utilizzando l'assorbanza a 260 nm
L'assorbanza è da decenni il metodo di scelta per la quantificazione di routine di DNA e RNA. È semplice e pratico da usare poiché non è richiesto alcun ulteriore trattamento del campione (diverso dall'estrazione del DNA) o reazione con altre sostanze. Tuttavia, non è molto specifico (misura tutti gli acidi nucleici nel suo insieme) e sensibile ai contaminanti, quindi richiede DNA molto puro per essere accurato. Ulteriori informazioni sulla purezza del DNA, su come misurarla e su come influisce sulla quantificazione.
L'assorbanza dei campioni di DNA a 260 nm viene attualmente misurata più spesso utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi, ma è anche possibile utilizzare uno spettrofotometro a cuvetta o un lettore di micropiastre.
In questo metodo, la concentrazione di una sostanza viene calcolata secondo la legge di Beer-Lambert in base alla sua assorbanza. La seguente formula può essere ottenuta dalla formulazione originale della legge:
Dove A = assorbanza a una data lunghezza d'onda, ε = coefficiente di estinzione, b = lunghezza del percorso dello spettrofotometro, c = concentrazione del campione.
Quindi, per una lunghezza del percorso di 1 cm, la concentrazione è uguale all'assorbanza a 260 nm (il picco di assorbimento degli acidi nucleici), divisa per il coefficiente di estinzione.
Formula per calcolare la concentrazione del DNA
dsDNA ha un coefficiente di estinzione di 0,02 (µg / mL)-1 cm-1, quindi:
La stessa formula può essere utilizzata con i rispettivi coefficienti di estinzione per ssDNA (assorbanza x 37 µg / mL) e ssRNA (assorbanza x 40 µg / mL). Tuttavia, è importante notare che la formula è valida solo per molecole di acido nucleico di grandi dimensioni con una proporzione simile di tutti i nucleotidi, come DNA genomico, plasmidi, ecc. Per gli oligonucleotidi e altre molecole di acido nucleico corto come i miRNA, il coefficiente di estinzione deve essere calcolato dalla sequenza dell'oligonucleotide.
Il metodo della difenilammina (Test di Dische)
Un altro metodo per quantificare il DNA mediante assorbanza è il metodo della difenilammina, che si basa sulla reazione della difenilammina con lo zucchero desossiribosio per formare un complesso blu. Questo metodo richiede tempo, ha una bassa sensibilità e quindi non è più utilizzato nella maggior parte dei laboratori. Tuttavia, la misura viene eseguita nel campo visibile e può essere eseguita a 595 nm con un lettore ELISA standard se non sono disponibili altri strumenti.