Cos’è il Crosstalk?
Nel campo della misura a micropiastra il crosstalk indica quanto un segnale prodotto nel pozzetto di una micropiastra rimane in quel pozzetto senza interferire con i segnali dei pozzetti adiacenti. Ciò può provocare segnali artificialmente elevati e rappresenta un problema importante quando si analizzano campioni di segnale basso adiacenti a campioni di segnale alto. La tipica soluzione alternativa è cercare di separare i campioni ad alto segnale dagli altri per evitare il più possibile il crosstalk, ma questo sta sprecando pozzetti preziosi e non è un'opzione quando il throughput è alto. Quindi, cosa dovresti considerare quando riduci al minimo il crosstalk nel tuo test?
Influenza dell’assay sul crosstalk
In generale, la potenza del segnale dell'assay è una considerazione importante. Assays come ad esempio gli assays chemiluminescenti possono generare segnali relativamente alti, portando a un crosstalk significativo. Inoltre, la lunghezza d'onda della luce emessa è un'altra considerazione da fare. Più corta è la lunghezza d'onda dell'emissione, maggiore è il suo livello di energia, che renderà il tuo assay più incline al crosstalk.
D'altro canto, i test di fluorescenza sono meno inclini al crosstalk. Normalmente solo il pozzetto misurato è illuminato dalla luce di eccitazione e la durata della fluorescenza è molto breve (nell'ordine dei nanosecondi per assays di fluorescenza rapidi).
Ci sono altri due fattori importanti che influenzano il crosstalk, la micropiastra utilizzata può avere un impatto significativo sul livello di crosstalk che osserverete. Inoltre, il design dello strumento influenzerà il livello di crosstalk.
Influenza delle micropiastre sulla crosstalk
Le micropiastre per lo sviluppo di analisi e lo screening ad alto Throughput sono generalmente prodotte da un polimero di polistirene e per le piastre bianche viene aggiunto un sbiancante ottico, ossido di titanio. Questo per aumentare la riflettività con una superficie luminosa molto liscia all'interno dei pozzetti. Di seguito sono riepilogate le considerazioni generali sulla progettazione della piastra che avranno un impatto sul livello di crosstalk che osserverete:
Plastica e colore della Micropiastra
- Le micropiastre nere mostrano la quantità più bassa di crosstalk, seguite dalle micropiastre grigio chiaro.
- Il potenziale di crosstalk delle micropiastre bianche varia con il livello di ossido di titanio utilizzato.
- Le micropiastre trasparenti offrono il massimo crosstalk, poiché la luce può attraversare liberamente le pareti e non dovrebbero mai essere utilizzate per alcun assay di luminescenza.
Design della Micropiastra
La geometria del pozzetto, la distanza da pozzetto a pozzetto, lo spessore della parete dei pozzetti adiacenti e il fondo del pozzetto hanno tutti un'influenza sul livello di crosstalk che si osserverà.
Berthold Technologies fornisce micropiastre più adatte per misure di luminescenza, fluorescenza e assorbanza.
Influenza dello strumento sul crosstalk
I lettori di micropiastre ad alte prestazioni in genere dispongono di tecnologie che riducono il crosstalk a livelli trascurabili. L'allineamento dei vari componenti nel percorso ottico è stato ottimizzato per evitare che il segnale dai pozzetti adiacenti raggiunga il pozzetto misurato. Inoltre, sono stati applicati dispositivi di mascheramento fisico per isolare il pozzetto misurato dai pozzetti adiacenti.
In Berthold Technologies abbiamo un design brevettato per eliminare i segnali dai pozzetti non misurati per interferire con i pozzetti misurati e questa caratteristica è presente in tutti i nostri lettori di micropiastre. La specifica del crosstalk per la maggior parte dei nostri lettori di piastre è 10-6 e ciò equivale a 1.000.000 di conteggi in un pozzetto e solo 1 conteggio in tutti i pozzetti adiacenti. I lettori di piastre di altri produttori vedranno conteggi variare da 100 a oltre 5000 nei pozzetti adiacenti. Come puoi vedere, il design intelligente dello strumento può ridurre efficacemente il crosstalk fisico tra pozzetti adiacenti praticamente a zero.