Ritmos circadianos
Los relojes biológicos endógenos impulsan los ritmos diarios que permiten a los organismos anticiparse a los cambios ambientales, así como coordinar y adaptar su fisiología de manera sincronizada. El reloj circadiano permite a las plantas anticiparse y responder a las variaciones ambientales y, por lo tanto, mejora su estado. Las señales ambientales y metabólicas suministran información a este reloj, que se compone de una red de genes, y lo mantienen sincronizado con los ciclos día/noche. A cambio, el reloj controla varias vías y se asegura de que se activen en el momento adecuado del día. La luz es uno de los llamados Zeitgebers, o marcadores de tiempo, que pueden restablecer el reloj.
Imagen IN VIVO EN LA INVESTIGACIÓN DEL RITMO CIRCADIANO
La investigación sobre los ritmos circadianos se beneficia del monitoreo en tiempo real de líneas reportera en las que el promotor de un gen de interés impulsa la expresión de la luciferasa pGENE::LUC+ en combinación con sistemas de imagen de alta sensibilidad. La monitorización de la expresión de luciferasa de luciérnaga usando un sistema de captación de imagen in vivo permite obtener información en tiempo real de la expresión génica regulada de forma no invasiva. Esta técnica es ampliamente aplicable al análisis de la regulación transcripcional, postranscripcional o traduccional. Además, la inestabilidad de la actividad de la luciferasa permite que el marcador bioluminiscente refleje tanto los aumentos como las disminuciones en la expresión durante un transcurso de tiempo de varias horas. De esta manera, es posible investigar el enfoque tisular del reloj circadiano y sus características, o seleccionar mutantes defectuosos en la regulación espacial de la expresión de genes de interés.
El NightShade
El sistema de imagen in vivo NightShade utiliza una cámara CCD de bajo ruido y alta sensibilidad y es adecuado tanto para luminiscencia como para fluorescencia. NightShade ha sido diseñado específicamente para imágenes de plantas y tiene numerosas ventajas en comparación con las cámaras de uso general o los sistemas de imágenes diseñados para la investigación con animales:
- Simulación de luz diurna con calidad e intensidad de luz flexibles.
- Software intuitivo con potente programador, que permite programar la intensidad y calidad de luz deseadas durante varios días y capturar imágenes en los momentos deseados.
- Puertos herméticos a la luz para insertar tubos para irrigación (críticos para experimentos de varios días) o para otros objetivos.
- Tamaño de muestra flexible: desde plántulas en placas de Petri hasta plantas en macetas.
- Posición lateral de montaje de la cámara para obtener imágenes de plantas enteras, desde la hoja hasta las raíces.
- Bandeja anticondensación con control de temperatura para imágenes de alta calidad cuando se trabaja con placas de Petri
Nota de aplicación
En los organismos multicelulares, los relojes circadianos son variables a nivel individual, tisular y celular, lo que puede desembocar en datos ruidosos o inexactos. Por lo tanto, se requiere robustez para abordar con precisión las preguntas clave en la biología circadiana. Esta nota de aplicación presenta un protocolo simple para experimentos de ritmos circadianos con líneas reporteras de Arabidopsis thaliana utilizando el NightShade, que mejora la calidad de los datos, reduce la variación de luminiscencia entre réplicas y se correlaciona altamente con las predicciones de los modelos.