Auf Absorption basierende Verfahren
UV-Spektrophotometrie mittels Absorption bei 260 nm
Absorption ist seit Jahrzehnten die Methode der Wahl für die routinemäßige Quantifizierung von DNA und RNA. Die Anwendung ist einfach und bequem, da keine weitere Probenbehandlung (über die DNA-Extraktion hinaus) oder Reaktion mit anderen Substanzen erforderlich ist. Sie ist jedoch nicht sehr spezifisch (sie misst alle Nukleinsäuren in ihrer Gesamtheit) und empfindlich gegenüber Verunreinigungen, so dass sie sehr reine DNA benötigt, um genau zu sein. Erfahren Sie mehr über die DNA-Reinheit, wie man sie misst und wie sie die Quantifizierung beeinflusst.
Die Absorption von DNA-Proben bei 260 nm wird derzeit am häufigsten mit einem Mikrovolumen -Spektrophotometer gemessen, aber es ist auch möglich, ein Küvettenspektrophotometer oder einen Mikroplatten-Reader zu verwenden. Erfahren Sie mehr über Instrumente, die sich für die DNA-Quantifizierung eignen.
Bei diesem Verfahren wird nach dem Bier-Lambert-Gesetz die Konzentration einer Substanz basierend auf ihrer Absorption berechnet. Aus der ursprünglichen Formulierung des Gesetzes kann die folgende Formel gewonnen werden:
Wobei A = Absorption bei einer gegebenen Wellenlänge, ε = Extinktionskoeffizient, b = Pfadlänge des Spektrophotometers, c = Konzentration der Probe.
Bei einer Pfadlänge von 1 cm ist die Konzentration also gleich der Absorption bei 260 nm (dem Absorptionspeak von Nukleinsäuren), dividiert durch den Extinktionskoeffizienten.
Formel zur Berechnung der DNA-Konzentration
dsDNA besitzt einen Extinktionskoeffizienten von 0.02 (µg/mL)-1 cm-1, also:
Die gleiche Formel kann mit den jeweiligen Extinktionskoeffizienten für ssDNA (Absorption x 37 µg/ml) und ssRNA (Absorption x 40 µg/ml) verwendet werden. Es ist jedoch zu beachten, dass die Formel nur für große Nukleinsäuremoleküle mit einem ähnlichen Anteil aller Nukleotide, wie genomische DNA, Plasmide usw. gilt. Für Oligonukleotide und andere kurze Nukleinsäuremoleküle, wie miRNAs, muss der Extinktionskoeffizient aus der Sequenz des Oligonukleotids berechnet werden.
Die Diphenylamin-Methode (Dische-Test)
Eine weitere Möglichkeit, DNA mittels Absorption zu quantifizieren, bietet die Diphenylamin-Methode: Sie basiert auf der Reaktion von Diphenylamin mit Desoxyribose-Zucker, wodurch ein blau gefärbter Komplex entsteht. Diese Methode ist zeitaufwendig , besitzt nur eine geringe Empfindlichkeit und wird deshalb in den meisten Labors nicht mehr eingesetzt. Die Messung erfolgt jedoch im sichtbaren Bereich und kann bei 595 nm mit einem Standard-ELISA-Lesegerät durchgeführt werden, wenn keine anderen Instrumente verfügbar sind.