Absorption oder Fluoreszenz?
Die gängigsten Methoden zur DNA-Quantifizierung sind die UV-Spektrophotometrie und die Messung der Fluoreszenz von DNA-bindenden Farbstoffen. Die erstgenannte Methode erfordert ein Messinstrument, das für die Absorptionsmessung geeignet ist, und die letztgenannte ein Instrument, das zur Fluoreszenzmessung eingesetzt werden kann. Daher ist die erste Entscheidung vor der Wahl eines Instruments die zu verwendende DNA-Quantifizierungsmethode.
Absorptions-Reader
Die beiden wichtigsten Optionen für die Quantifizierung der DNA-Konzentration mittels Absorptionsmessungen sind Mikrovolumen-Spektrophotometer und Absorptions-Mikroplattenreader.
Mikrovolumen-Spektrophotometer
In der Vergangenheit war die Küvetten-Spektrophotometer die einzig verfügbare Option zur Quantifizierung der DNA-Konzentration mittels Absorptionsmessungen. Ihre Anwendung war aber aufgrund des großen benötigten Probenvolumens, und des geringen verfügbaren Probenvolumens in der Molekularbiologie jedoch sehr eingeschränkt. Zwar ist die Empfindlichkeit eines Küvetten-Spektrophotometers besser, als die eines Mikrovolumen-Spektrophotometers, jedoch ist die benötigte Probenmenge sehr groß: 300-400 µL in Halbmikroküvetten und 70 µL in Ultramikroküvetten. Ein echter Durchbruch in der Anwendung der Methode gelang erst mit der Einführung von Mikrovolumen-Spektrophotometern, die die Messung winziger Tropfen der Probe (typischerweise 1 µL) ermöglichen. Daher wurden Küvettenspektrophotometer zur DNA-Quantifizierung in der Zwischenzeit weitgehend aufgegeben, und Mikrovolumenspektrometer sind das Instrument der Wahl für die Einzelproben-Absorptionsmessungen.
Die Quantifizierung der DNA mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer ist einfach und unkompliziert, jedoch müssen die Proben einzeln mit einem kurzen Reinigungsschritt zwischen den einzelnen Proben gemessen werden, was zeitaufwendig ist, wenn eine große Anzahl von Proben quantifiziert werden muss. Um mehr Proben in kürzerer Zeit zu messen, empfiehlt sich daher der Einsatz eines Mikroplatten-Readers.
Mikroplatten Absorptions-Reader
Mikroplatten-Reader können viele Proben in kurzer Zeit messen: Typische Plattenformate sind 96- und 384-Well, aber in manchen Readern können auch Platten mit 1536 Wells oder mehr gelesen werden. Allerdings haben sie einige Limitierungen bei der Berechnung der DNA-Konzentrationen im Vergleich zu Mikrovolumen-Spektrophotometern:
- Sie benötigen für die Messung größere Probenvolumina. Dies ist abhängig vom jeweiligen Plattentyp und Hersteller. Je höher die Well-Dichte, desto geringer ist das minimale Arbeitsvolumen, und es gibt Low-Volume-Ausführungen der gängigsten Mikroplattenformate. In den meisten Fällen erfordert die Messung in Mikroplatten jedoch immer noch ein Mehrfaches an Probenvolumen im Vergleich zur Messung in einem Mikrovolumenspektrophotometer. In der Tabelle am Ende des Artikels finden Sie das minimale Arbeitsvolumen der gängigen Mikroplattenformate.
- Standard-Polystyrol-Mikrotiterplatten können nicht verwendet werden, da sie das UV-Licht blockieren. Spezielle Mikrotiterplatten, die für UV-Strahlung transparent sind, sind derzeit von den meisten großen Herstellern erhältlich. Obwohl sie teurer sind als Polystyrol-Mikroplatten, sind sie erschwinglicher und zweckmäßiger als Quarz- oder Quarz-Boden-Mikroplatten.
- Die Pfadlänge, die ein Faktor in der Formel zur Berechnung der DNA-Konzentration ist (siehe DNA-Quantifizierungsmethoden) hängt von der Wellgeometrie und dem Probenvolumen ab. Da die Formel zur Berechnung der DNA-Konzentration eine Weglänge von 1 cm voraussetzt, muss bei Mikroplattenmessungen die Weglängenkorrektur verwendet werden. Die Weglängenkorrektur lässt sich leicht berechnen, wenn die Absorption der Proben bei 900 und 975 nm gemessen wird.
Mikrovolumen-Mikroplatten zur DNA-Quantifizierung
Ein Workaround für alle drei Probleme ist die Verwendung von Mikrovolumen-Mikroplatten zur DNA-Quantifizierung. Diese Art von Mikroplatten verwendet kleine Probenmengen (in der Regel 2 µL), ist UV-lichtdurchlässig und hat eine feste Schichtdicke, die ohne zusätzliche Messungen leicht auf die Berechnungen angewendet werden kann. Obwohl sie nicht so viele Probenpositionen wie Standard-Mikroplatten (normalerweise 16 statt 96) haben, bieten sie einen guten Kompromiss zwischen Probenvolumen und Durchsatz. Für die komfortable Quantifizierung der DNA in unseren Mikroplatten-Lesegeräten bieten wir die µDrop-Platte an, inklusive Parameterdateien zur einfachen Messung und Berechnung mit der MikroWin-Software.
Was die Wahl des Mikroplatten-Readers betrifft, so ist die einzige Anforderung, die Absorption im UV bis zu 230 nm (da diese Wellenlänge zur Beurteilung der Reinheit der DNA verwendet wird) messen zu können (Link zur Anwendungsseite). Für diese Anwendung eignen sich sowohl filterbasierte als auch monochromatorbasierte Reader.