ZIRKADIANE RHYTHMEN
Endogene biologische Uhren steuern Tagesrhythmen, die es Organismen ermöglichen, Umweltveränderungen vorherzusehen und ihre Physiologie in synchronisierter Weise zu koordinieren und anzupassen. Die zirkadiane Uhr ermöglicht es Pflanzen, Umweltveränderungen vorauszusehen und darauf zu reagieren, und verbessert so ihre Fitness. Sowohl Umwelt- als auch Stoffwechselsignale fließen in die Uhr ein, die aus einem Netzwerk von Genen besteht, und halten sie mit dem Tag-Nacht-Zyklus synchronisiert. Im Gegenzug steuert die Uhr verschiedene Signalwege und sorgt dafür, dass sie zur richtigen Tageszeit aktiviert werden. Licht ist einer der so genannten Zeitgeber, die die Uhr zurücksetzen können.
IN-VIVO-BILDGEBUNG IN DER FORSCHUNG ZUM ZIRKADIANEN RHYTHMUS
Die Erforschung zirkadianer Rhythmen profitiert von der Echtzeitüberwachung von Reporterlinien, bei denen der Promotor eines interessierenden Gens die Expression von Luziferase pGENE::LUC+ in Kombination mit empfindlichen Bildgebungssystemen antreibt. Die Überwachung der Glühwürmchen-Luciferase-Expression mit einem In-vivo-Bildgebungssystem ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Berichterstattung über die regulierte Genexpression. Diese Technik ist für die Analyse der transkriptionellen, posttranskriptionellen oder translationalen Regulation breit einsetzbar. Darüber hinaus ermöglicht die Instabilität der Luziferaseaktivität, dass der biolumineszente Marker sowohl Zunahmen als auch Abnahmen der Expression über einen Zeitraum von mehreren Stunden rekapitulieren kann. Auf diese Weise ist es möglich, den Gewebefokus der zirkadianen Uhr und ihre Eigenschaften zu untersuchen oder nach Mutanten zu suchen, die bei der räumlichen Regulierung der Expression von Genen von Interesse defekt sind.
DIE NIGHTSHADE
Das NightShade In Vivo Imaging System verwendet eine rauscharme, hochempfindliche CCD-Kamera und ist sowohl für Lumineszenz als auch für Fluoreszenz geeignet. Die NightShade wurde speziell für die Bildgebung an Pflanzen entwickelt und bietet zahlreiche Vorteile im Vergleich zu Allzweckkameras oder Bildgebungssystemen für die Tierforschung:
- Tageslichtsimulation mit flexibler Lichtqualität und -intensität.
- Intuitive Software mit leistungsfähigem Planer, der es ermöglicht, die gewünschte Lichtintensität und -qualität über mehrere Tage zu programmieren und Bilder zu den gewünschten Zeitpunkten aufzunehmen.
- Lichtdichte Anschlüsse zum Einführen von Schläuchen für die Bewässerung (wichtig für die Bildgebung über mehrere Tage) und andere Ziele.
- Flexible Probengröße: von Sämlingen in Petrischalen bis zu Pflanzen in Töpfen.
- Seitliche Kamerahalterung für die Aufnahme ganzer Pflanzen, vom Blatt bis zu den Wurzeln.
- Antikondensationsschale mit Temperaturkontrolle für hochwertige Bilder bei der Arbeit mit Petrischalen.
APPLICATION NOTE
In multizellulären Organismen sind die zirkadianen Uhren auf individueller, geweblicher und zellulärer Ebene natürlich variabel, was zu verrauschten oder ungenauen Daten führt. Daher ist Robustheit erforderlich, um Schlüsselfragen der zirkadianen Biologie genau zu beantworten. In dieser Application Note wird ein einfaches Protokoll für zirkadiane Rhythmusexperimente mit Arabidopsis thaliana-Reporterlinien unter Verwendung der NightShade vorgestellt, das die Datenqualität verbessert, die Lumineszenzschwankungen zwischen den Wiederholungen reduziert und in hohem Maße mit Modellvorhersagen korreliert.