Was ist ein Pseudovirus Neutralization Assay?

Ein Pseudovirus Neutralization Assay (auch bekannt als Pseudotyped Virus Neutralization Assay oder Pseudotype-Based Neutralization Assay) ist eine Labormethode zur Untersuchung der Wirkung von Antikörpern oder Medikamenten, um die Fähigkeit von Viren in Zellen einzudringen zu neutralisieren und so eine Infektion zu verhindern.

Pseudotypen oder Pseudotyp-Partikel sind chimäre "Viren", die aus einem Viruskern (typischerweise ein lentiviraler Vektor) bestehen, der von einer Lipidhülle mit den Oberflächenglykoproteinen eines anderen Virus (dem Virus von Interesse) umgeben ist. Durch Verwendung eines Vektors, der sich nicht selbst replizieren kann und daher nicht pathogen ist, können Viren in einem sichereren System untersucht werden. Im Falle von SARS-CoV-2 muss das Pseudovirus das S-Glykoprotein exprimieren, das den Eintritt in die Wirtszellen vermittelt, indem es an das menschliche Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) bindet. Zusätzlich zu den Oberflächenglykoproteinen des betreffenden Virus enthält das pseudotypisierte Virus das Gen einer Luciferase, das erst nach dem Eintritt in die Zelle exprimiert wird. Je mehr Pseudoviren in die Zellen eindringen, desto mehr Luciferase wird exprimiert und desto höher ist die Intensität des ausgestrahlten Lichts.

Beim Pseudovirus Neutralization Assay werden die Zellen und das Pseudovirus in Gegenwart verschiedener Konzentrationen eines Antikörpers von Interesse inkubiert und die Lichtemission mit einem Lumineszenz Mikroplatten Reader oder einem Multimode Mikroplatten Reader gemessen. Wenn der Antikörper die Oberflächenglykoproteine wirksam neutralisiert und den Eintritt in die Zellen blockiert, wird eine signifikante Verringerung der Lichtemission gemessen. Die Wirkung des Antikörpers wird mit einer hemmenden Konzentration (IC50, IC80 oder andere) angezeigt.

Warum sind Pseudovirus Neutralization Assays so wichtig?

Neutralization Assays sind sehr wertvolle Instrumente zur Untersuchung menschlicher und tierischer Antikörperreaktionen gegen Viren, die durch Impfung und andere Therapien oder natürlicher Exposition hervorgerufen werden. Diese Assays erfordern routinemäßig den Einsatz von Wildtyp-Viren. Dies schränkt ihre Anwendung ein, wenn es sich bei dem Studienobjekt um ein hoch pathogenes menschliches Virus wie SARS-CoV-2 handelt.

Replikationsdefiziente Viren, die in Pseudotyped Virus Neutralization Assay verwendet werden, können jedoch eine sichere Alternative darstellen. Pseudoviren haben eine konformative Struktur der Oberflächenproteine, die der des nativen Virus von Interesse sehr ähnlich ist. Sie besitzen die gleiche Fähigkeit in Zellen einzudringen, da sie dieselben Mechanismen und Rezeptoren wie das Virus von Interesse verwenden. Pseudoviren sind aber viel sicherer in der Handhabung als das Virus, von welchem sie abstammen.

Die einzigartigen Eigenschaften von Pseudoviren ermöglichen den sicheren Umgang in Laboratorien der Biosicherheitsstufe (BSL) 2l. Diese arbeiten typischerweise mit Erregern, die ein mäßiges Gesundheitsrisiko für den Menschen darstellen. Dies ist ein großer Vorteil, da hoch pathogene Viren wie SARS-CoV-2 BSL-3-Labore erfordern: Während die meisten Forschungseinrichtungen über BSL-2-Labore verfügen, sind BSL-3-Labore viel seltener.

Und nicht zuletzt: Da die Methode auf Lumineszenz basiert, zeichnet sie sich durch eine hohe Empfindlichkeit und einen großen dynamischen Bereich aus.

Warum sollten Sie Instrumente von Berthold für Ihre Pseudovirus Neutralization Assays verwenden?

Berthold Technologies ist Ihr zuverlässiger und kompetenter Partner, wenn Sie Pseudotyped Virus Neutralization Assays durchführen wollen. Wir sind stolz darauf, uns zu den Pionieren der Lumineszenzmessung zu zählen und haben in den letzten vier Jahrzehnten mehr als 20 verschiedene Arten an Luminometern (vom Röhrchen bis zur Mikroplatte) konzipiert und entwickelt. Bekannt für Präzision, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit ist Berthold Technologies auch heute noch Marktführer für Luminometer.

Das Centro Mikroplatten Luminometer kann zur Messung der Luziferase-Aktivität verwendet werden. Es ist ein vielseitiges Instrument für Glow- und Flash-Lumineszenz-Assays, das mit bis zu drei Hochleistungsinjektoren ausgestattet werden kann. Das Mikroplatten Luminometer zeichnet sich auch durch eine hohe Empfindlichkeit aus, dank einer strengen Auswahl von Photomultipliern, die im Photonenzählmodus arbeiten. Aufgrund seines Designs zur Reduzierung des Crosstalk liefert der Centro sehr zuverlässige Ergebnisse. Seine Leistungsfähigkeit wird in den folgenden Artikeln gezeigt.

A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection

Naturally mutated spike proteins of SARS-CoV-2 variants show differential levels of cell entry 

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Der Tristar 5 ist ein modulares Hochleistungs-Plattenlesegerät, das mit unabhängigen, vom Benutzer wählbaren Filtern und Monochromatoren sowohl auf der Anregungs- als auch auf der Emissionsseite für alle Messungen ausgestattet ist. Er ist mit einer fortschrittlich zellschonenden Injektortechnologie und einer One-4-All-Optik für die kompromisslose Performance aller Detektionsmodi ausgestattet. 

Im folgenden Artikel wurde Gaussia anstelle des Glühwürmchens als Reportergen verwendet. Der Tristar 5 führte die Messung der Gaussia-Luciferase-Expression durch.

Potential host range of multiple SARS-like coronaviruses and an improved ACE2-Fc variant that is potent against both SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1

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Weitere Publikationen

In den folgenden Artikeln wurden Messungen mit früheren Instrumentenversionen der Tristar-Systemfamilie durchgeführt, können aber 1:1 auf die neuen Tristar-Systeme übertragen werden.

Autor und JahrTitelInstrument
Prévost et al. (2020)

Cross-sectional evaluation of humoral responses against SARS-CoV-2 Spike

TriStar LB 941 Multimode Platten Reader
Beaudoin-Bussières et al. (2020)Decline of humoral responses against SARS-CoV-2 Spike in convalescent individualsTriStar LB 941 Multimode Platten Reader

 

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